Inson quturgan vaktsinasini ishlab chiqarishda ultrafiltratsiyani qo'llash

Inson quturgan vaktsinasini ishlab chiqarishda ultrafiltratsiyani qo'llashni targ'ib qilish uchun 300kDa ultrafiltratsiya membranasi kassetasi quturgan virusi yig'im eritmasini konsentratsiyalash va ultrafiltratsiyadan keyin antigenni tiklash, endotoksinni olib tashlash tezligi va xost oqsilini olib tashlash tezligini aniqlash uchun ishlatilgan. Natijalar shuni ko'rsatdiki, tegishli bosim ostida quturish virusi o'rim-yig'im eritmasi 80 marta konsentratsiyalangan, 25 marta elutsiya qilingan, antigenni tiklash darajasi 86,2%, bakterial endotoksinni olib tashlash darajasi 87,5% ~ 88,7% va xost oqsilini olib tashlash darajasi 91,6% ni tashkil etdi.

 

Muqaddima

 

Quturma - bu quturish virusi (RV) keltirib chiqaradigan an'anaviy, qadimiy zoonoz kasallik bo'lib, o'lim darajasi 100% gacha. Hozirgi vaqtda favqulodda vaktsina va immunoglobulin bilan emlashdan tashqari, ta'sir qilishdan keyingi (ya'ni teri va shilliq pardalarning shikastlanishi) samarali davolash yo'q. Odamlarda quturishning asosiy manbai kasal yoki potentsial kasal hayvonlarning (asosan itlar) chaqishi hisoblanadi. Xitoyda quturishdan o'lim darajasi dunyoda ikkinchi o'rinda turadi va quturish mamlakatimizda sog'liqni saqlash xavfsizligiga tahdid soladigan muammolardan biridir. Himoya neytrallashtiruvchi antikor ishlab chiqarishni qo'zg'atuvchi yagona asosiy antijen bo'lgan quturgan virusning kapsulali glikoproteini yangi vaktsinalarni va quturish virusini tashxislash va davolashning yangi texnologiyalarini tadqiq qilish va ishlab chiqish markazi bo'ldi.

 

Quturma virusi rabdoviruslar oilasining quturgan virusi turiga kiradi. Nukleokapsidning shakli elastik, nukleokapsid spiralsimon simmetrik, yuzasida bir ipli RNK bo'lgan konvert mavjud. Bu quturish kasalligini qo'zg'atuvchi patogen. Quturma virusining ikkita asosiy antijeni mavjud: biri virusning tashqi membranasidagi glikoprotein antijeni bo'lib, u virusni neyrotoksik qilish uchun atsetilxolin retseptorlari bilan bog'lanishi va organizmda neytrallashtiruvchi antikorlar va gemagglyutinatsiyani inhibe qiluvchi antikorlarni ishlab chiqarishi mumkin va neytrallashtiruvchi antikorlar himoya ta'siri; Ikkinchisi ichki riboprotein antijeni bo'lib, u organizmni komplementni bog'laydigan antikorlar va presipitin ishlab chiqarishi mumkin va himoya ta'siriga ega emas.

 

Endotoksin - bu issiqlikka chidamlilik va kimyoviy barqarorlikka ega bo'lgan va yo'q qilinishi oson bo'lmagan lipopolisakkarid moddasi (LPS). Vaktsinada ma'lum bir endotoksin kontsentratsiyasi mavjud bo'lsa, u emlashdan keyin kuchli isitma va hatto o'limga olib keladi, shuning uchun emlashda endotoksinning tarkibini iloji boricha kamaytirish kerak. Xitoy farmakopeyasining 2005 yil nashri (III qism) quturgan vaktsina endotoksinining malakali indeksining nazorat qiymati 100EU/dozadan yuqori bo'lmasligi kerakligini aniqladi. Membranani ajratish texnologiyasining jadal rivojlanishi bilan vaktsinalardagi endotoksin miqdorini kamaytirish uchun ultrafiltratsiyali membranani ajratish texnologiyasini qo'llash farmatsevtika sanoatida tobora keng tarqalmoqda.

 

Quturmaga qarshi emlash quturishga qarshi emlashdir. Odatda quturishga qarshi vaktsinalarning uch turi mavjud, jumladan, tozalangan Vero hujayrali vaktsina, inson diploid hujayrali vaktsina va birlamchi hujayra madaniyatiga qarshi vaktsina. Quturmaga qarshi emlash quturgan virusi fiksatsiyalangan virusni hujayra matritsasiga ekish, ekish, yig'ish, konsentratsiya, inaktivatsiya, tozalash va tegishli stabilizatorni qo'shish orqali amalga oshiriladi. Quturmaga qarshi vaktsinaning asosiy vazifasi organizmni tez immunitet reaktsiyasini yaratish va quturish virusiga qarshi himoya antikorlarini ishlab chiqarishni rag'batlantirish, virus keltirib chiqaradigan infektsiyani oldini olish va kasallik xavfini kamaytirishdir.

 

 

Vaksinani ishlab chiqarish jarayoni vaktsina sifatini ta'minlashda muhim rol o'ynaydi, ayniqsa ishlab chiqarish jarayonida ayrim ko'rsatkichlarning miqdorini aniqlash muhimroqdir. Inson quturgan vaktsinasini ishlab chiqarish jarayonida ultrafiltratsiya kontsentratsiyasi texnologiyasi inson quturgan vaktsinasini ishlab chiqarish uchun zarur vositadir. Ultrafiltratsiya kontsentratsiyasi uchun oqilona diafragma ultrafiltratsiya membranasidan foydalanish endotoksin va xost oqsilini samarali ravishda olib tashlashi va RV antijenini saqlab qolishi mumkin, bu esa emlash ishlab chiqarish va sifatni yaxshilashga yordam beradi. RV molekulalarining nisbiy molekulyar massasi 350kDa ~ 460kDa ni tashkil qiladi va nazariy jihatdan RV ni 100kDa va 300kDa tutuvchi molekulyar og'irligi bo'lgan membrana kassetasi yordamida ultrafiltratsiya kontsentratsiyasi bilan to'liq ushlab turish mumkin. Endotoksin ko'pincha turli xil suvli eritmalarda agregat tuzilmasini hosil qiladi, chunki agregatsiya darajasi, molekulyar hajmi har xil bo'ladi. Endotoksin monomerining nisbiy molekulyar massasi 10kDa ~ 20kDa, polimerizatsiya shaklining nisbiy molekulyar massasi esa 300kDa ~ 1000kDa yoki 1000kDa dan ortiq. Molekulyar og'irlikdagi farqdan kelib chiqqan holda, odam quturganga qarshi vaktsinadagi RV antijeni saqlanib qoldi va odam quturganga qarshi vaktsinadagi endotoksin va xost oqsili 300kDa ultrafiltratsiya membranasi bilan olib tashlandi.

 

Ushbu tajribada 300kDa diafragma va 0,11 m2 membrana maydoniga ega bo'lgan ultrafiltratsion membrana kassetasi inson quturganga qarshi vaktsina oraliq mahsulotlarini konsentratsiyalash uchun kichik namunali davolash sifatida ishlatilgan va membrana oqimi, davolash samaradorligi, konsentratsiyaning ko'pligi, antigenni ushlab turish, endotoksinni olib tashlash. , va xost oqsilini olib tashlash sinovdan o'tkazildi.

 

2Materiallar usuli

 

2.1 Eksperimental materiallar

Quturma virusi fiksatsiyalangan virus CTN-IV shtammi; Vero hujayralari; 0.5M natriy gidroksid; 300kDa ultrafiltratsion membrana kassetasi (PES materiali, 0,11m² membrana maydoni).

 

2.2 Eksperimental usullar

2.2.1 Viruslarni yig'ish uchun eritma tayyorlash

Muzlatilgan Vero xujayralari 37 ° ~ 39 ° C haroratda iliq suvda reanimatsiya qilindi, hujayra suspenziyasi chiqarib yuborildi va keyin 10% faolsizlangan buzoq zardobini o'z ichiga olgan 199 madaniyat muhitiga qo'shildi. Yagona monoqatlamli hujayralar 37 darajada ekilgan. CTN-IV shtammi 0.1mol/L nisbatda quturgan virusi bilan emlangan va 37 darajada ekilgan. 48 soatdan so'ng, madaniyat muhiti tashlab yuborildi va madaniyatni 33 ° ~ 35 ° C da ushlab turish uchun 0,1% inson qon albuminini o'z ichiga olgan 199 madaniy muhit qo'shildi. Har 3 kun{16}}kunda bir marta kasallik zaharini yig'ib oling va bir nechta hosilni birlashtiring.

 

2.2.2 Membran kassetasini o'rnatish

Membran kassetani o'rnating va quyidagi rasmda ko'rsatilgandek simlarni ulang.

 

2.2.3 Suv bilan yuvish

Kirish vanasini, qaytarish valfini va o'tish valfini yoping va qaytib uchini va oxirgi trubkani chiqindi suyuqlik idishiga joylashtiring. Qabul qilish idishini in'ektsiya uchun 1 litr suv bilan to'ldiring.

Kirish va qaytarish klapanlarini oching, o'tish klapanlarini yoping, nasosni oching, qaytish liniyasini 10% hajmdagi tozalangan suv yoki in'ektsiya uchun suv bilan tozalang va kirish bosimini 0,35 bar (5psi) darajasida saqlang.

Filtr klapanini oching, qaytarish valfini yoping va qolgan inyeksiya suvidan filtr trubasini tozalash uchun foydalaning, TMP qiymatini 0,35 barda saqlang.

 

2.2.4 Dezinfeksiya

Kirish valfini, qaytarish valfini va uzatish valfini yoping va qaytib uchi va uzatish uchi liniyalarini chiqindi suyuqlik idishiga joylashtiring. Qabul qilish idishini 2 litr tozalovchi eritma bilan to'ldiring.

Kirish va qaytarish klapanlarini oching, o'tish klapanlarini yoping, nasosni oching, qaytish liniyasini 200mL 0,5M natriy gidroksid bilan tozalang va kirish bosimini 0,35bar (5psi) darajasida saqlang. .

O'tkazuvchi valfni oching, qaytarish valfini yoping va o'tish trubkasini 200ml hajmdagi tozalash eritmasi bilan tozalang, TMP ni 0,35 barda saqlang.

Keyin qaytib uchi va o'tkazgich trubkasi tsiklik tozalash uchun suyuqlik idishiga kiritiladi. 30 daqiqa davomida jarayonning tangensial oqim tezligidan 1 ~ 1,5 baravar ko'p tozalash tsikli.

0.5M natriy gidroksidni to'kib tashlang va 2.2.4 ga muvofiq in'ektsiya uchun suv bilan neytral holga kelguncha yuving.

 

2.2.5 Suv oqimini tekshirish

Qabul qilish idishiga tozalangan suv qo'shing, suv olish idishidagi suv haroratini o'lchang va yozib oling. Qaytish uchini tankga joylashtiring. Nasosni ishga tushiring va 0.35bar (5psi) membrana bosimi farqiga erishish uchun nasos tezligini va qaytarish valfini sozlang. Tsilindrdan foydalanib, oqim tezligini ml/min da o'lchang va yozib oling. 1bar (15psi) transmembran differensial bosimini olish uchun nasos tezligini va qaytarish valfini sozlang. Tsilindrdan foydalanib, oqim tezligini ml/min da o'lchang va yozib oling.

Suv oqimi qiymatini standartlashtirish uchun hisoblangan suv oqimi qiymatini transmembran bosim farqiga bo'ling va quyidagi jadvaldagi haroratni to'g'rilash koeffitsientini ko'paytiring.

 

2.2.6 Ultrafiltratsiya konsentratsiyasi

Tizimdan suvni bufer ustki qismi bilan yuvib tashlang. Tizimning pH va ion barqarorligini sozlash uchun 5 daqiqa davomida aylantiring. Agar haroratni sozlash kerak bo'lsa, tizim harorati barqaror bo'lguncha tsiklni davom ettiring.

Qabul qilish idishiga ozuqa suyuqligini qo'shing, besleme oqimi tezligini (masalan, 400LMH) o'rnating va turli TMP qiymatlarida oqim tezligini sinab ko'ring. Sinov ma'lumotlariga ko'ra, abscissa sifatida TMP va ordinat sifatida Flux bilan egri chizilgan.

Quvurni to'g'ridan-to'g'ri to'plash tanklari, chiqindi suyuqlik idishlari va texnologik drenajlar kabi mos idishga yoki drenajga yo'naltiring.

Oziqlantirish idishidagi oziqlantiruvchi suyuqlikning dastlabki og'irligini yozib oling, besleme pompasini ishga tushiring va oziqlantiruvchi suyuqlikni 3 daqiqadan 4 minutgacha sekin aylantiring. Qayta aylanish oqim yo'lidagi qoldiq havoni olib tashlashga yordam beradi va shu bilan filmning ishlashini maksimal darajada oshiradi.

O'tkazuvchi valfni oching, optimal tangensial oqim tezligiga erishilgunga qadar nasos tezligini sekin oshiring va tizimning optimal TMP ga erishish uchun qaytib valfni sozlang.

Keyin trubkani yig'ish idishiga soling, suyuqlik idishga kirganda vaqtni boshlang va kirish va qaytish bosimini tegishli vaqt oralig'ida yozib oling va suyuqlikning vaqt o'tishi bilan qaytib keladigan uchida va oxiridan bir lahzani hisoblash uchun sifatini yozib oling. oqim darajasi.

Namunaning ultrafiltratsiya kontsentratsiyasi ozuqaning suyuqlik hajmi maqsadli konsentratsiya hajmiga kamaytirilganda yakunlanadi.

 

2.2.7 Dializ

Qabul qilish trubkasini, to'ldirish trubkasini va qaytib trubkani qabul qilish idishiga soling, uzatish trubkasini yig'ish idishiga soling va yig'ish idishini tozalash uchun balansga qo'ying.

Qaytish valfini oching, kirish pompasini ishga tushiring, o'tish valfini oching, nasos tezligini va TMP ni tegishli qiymatga sozlang. To'ldirish pompasini oching, qabul qilish idishidagi suyuqlik hajmini o'zgarmagan holda saqlang va teng hajmdagi dializni boshlang. Suyuqlik idishga kirganda vaqtni boshlang va tegishli vaqt oralig'ida kirish uchidagi bosimni, qaytib keladigan uchini va suyuqlikning massasini yozib oling va hisoblash yo'li bilan bir lahzali oqim tezligini oling.

 

2.2.8 CIP

Avval tampon bilan yuvib tashlang, so'ngra in'ektsiya uchun suv bilan yuving (operatsiya 2.2.3), keyin tozalash vositasi bilan tozalang (operatsiya 2.2.4) va oxirida in'ektsiya uchun suv bilan yuving (operatsiya 2.2.3).

 

2.2.9 Suv oqimini tekshirish

Amaliyot quyidagicha: 2.4.5.

 

2.2.10 Membranali kassetani saqlash

Qisqa muddatli saqlash (3 kundan kam yoki unga teng), membrana kassetasini moslamada saqlang va saqlash eritmasidan 10 daqiqadan 15 minutgacha aylanish uchun foydalaning, tizim valfini yoping, suyuqlik pompasiga quvvat manbaini uzib qo'ying va ta'minlang. suyuqlik kirish idishining to'g'ri muhrlanganligi.

Agar saqlash muddati 3 kundan 1 oygacha bo'lsa, membrana kassetasini armaturadan olib tashlang va uni plastik to'rva yoki boshqa havo o'tkazmaydigan idishga soling. Taxminan 50 dan 100 ml gacha saqlash eritmasidan plastik to'rva yoki havo o'tkazmaydigan idishga soling va uni yoping. Yoki uni to'g'ridan-to'g'ri saqlash eritmasiga botirish mumkin. Quyidagi jadvalda saqlash shartlari tavsiya etiladi.

 

3 Natijalar va tahlillar

 

3.1 Pirojenni yo'qotish samaradorligining ta'sir etuvchi omillarini o'rganish

Ultrafiltratsiya ish bosimi: 15 ta sinov partiyalari doimiy ravishda ishladi. Har bir partiyada filtrlash bosimi ultrafiltratsiya paytida 5, 10, 15 va 2{0}}psi darajasida ushlab turildi va virusni yig'ish suyuqligi 30 marta konsentratsiya qilindi va bufer suyuqlik bilan elutildi. (hajmi 10 marta) uzluksiz oqimda. Natijalar quyidagi jadvalda ko'rsatilganidek, endotoksinni olib tashlash darajasi 87,0% dan kam, antigenning tiklanish darajasi 86,0% da barqaror va xost oqsilini olib tashlash darajasi 90,0% da barqaror edi. turli operatsion bosimlar antigenni tiklash, endotoksinni olib tashlash va xost oqsilini olib tashlash ta'siriga juda oz ta'sir ko'rsatdi.

Ultrafiltratsiya kontsentratsiyasi nisbati: 15 ta sinov partiyasi doimiy ravishda bajarildi. Har bir partiyada virus yig‘uvchi suyuqlik ultrafiltratsiya jarayonida mos ravishda 3{12}} marta, 50 marta, 80 marta va 100 marta konsentratsiyalangan. Filtrlash bosimi 20psi darajasida ushlab turildi va bufer suyuqligi (hajmning 10 barobari) uzluksiz oqimda tozalandi. Natijalar quyidagi jadvalda ko'rsatilganidek, endotoksinni olib tashlash darajasi 53,3% dan 86,9% gacha, antigenni qayta tiklash darajasi barqaror 86,0% va xost oqsilini olib tashlash tezligi. 91,0% da barqaror edi. Segmentlangan namuna olishda transmissiya eritmasida antigen aniqlanmadi va konsentrlangan virus eritmasida xost oqsilining 10% dan kamrog'i qoldi. Virusning konsentrlangan eritmasidagi endotoksin kontsentratsiyasi kontsentratsiya vaqtlarining oshishi bilan ortdi va endotoksinni olib tashlash darajasi konsentrlangan namunada 80 marta eng yuqori bo'ldi va ishlab chiqaruvchi nafaqat 100 marta konsentratsiyani hisobga olishi mumkin edi. ishlab chiqarish samaradorligini oshirdi va tannarxni pasaytirdi, ammo vaktsina ishlab chiqarish talablariga javob berdi.

 

3.2 Membran kassetalari oqimining kamayishi va tozalash regeneratsiyasi

Davolashdan keyin membrana oqimining tiklanish darajasi 92,6% ni tashkil etdi. Yangi membrana kassetasining birinchi tiklanish tezligi normal bo'lib, oziqlantiruvchi suyuqlikning joriy kuzatuv xususiyatlariga ko'ra, ikkinchi va NTH vaqtlarining keyingi prognozi, membrana kassetasi oqimining tiklanish tezligi ushbu davolashdan keyin ma'lumotlarga yaqin bo'ladi va barqaror bo'lishga moyil. Bir martalik foydalanishdan keyin 2 soat ichida membrana kassetasining kamayishi ideal bo'ldi va umumiy ish sharoitida membrana oqimining atigi 10% tugadi.

3.2.1 Membranali kassetali ishlov berish jarayonida oqimning kamayishi

3.2.2 Membranali kassetani tozalash va qayta tiklash natijasi

 

Guidling haqida

 

Guidling Technology - bu biofarmatsevtika, hujayra madaniyati, biomeditsinani tozalash va konsentratsiyalash, diagnostika va sanoat suyuqliklariga qaratilgan milliy yuqori texnologiyali korxona. Biz santrifüj filtr qurilmalari, ultrafiltratsiya va mikrofiltratsiya kassetalari, virus filtri, TFF tizimi, chuqurlik filtri, ichi bo'sh tolalar va boshqalarni muvaffaqiyatli ishlab chiqdik. Ular biofarmatsevtika, hujayra madaniyati va boshqalarni qo'llash stsenariylariga to'liq javob beradi. Bizning membranalarimiz va membrana filtrlarimiz konsentratsiya, ekstraktsiya va oldindan filtrlash, mikrofiltratsiya, ultrafiltratsiya va nanofiltratsiyani ajratishda keng qo'llaniladi. Kichik, bir martalik laboratoriya filtrlashdan ishlab chiqarish filtrlash tizimlariga, sterillik sinovlari, fermentatsiya, hujayra madaniyati va boshqalarga qadar ko'plab mahsulot liniyalarimiz sinov va ishlab chiqarish ehtiyojlarini qondiradi. Guidling Technology siz bilan hamkorlik qilishni intiqlik bilan kutmoqda!