Pastki oqimdagi ultrafiltratsiya / diafiltratsiya kontsentratsiyasi jarayoni: maqsadli oqsil o'tishi va yo'qolishini qanday samarali tarzda oldini olish mumkin

Pastki oqimdagi ultrafiltratsiya / diafiltratsiya kontsentratsiyasi jarayoni: maqsadli protein o'tkazuvchanligi va yo'qolishini qanday samarali tarzda oldini olish mumkin

Rekombinant oqsillar, qon mahsulotlari va boshqa biologik moddalarni tozalash jarayonlarida ultrafiltratsiya/diafiltratsiya (UF/DF) xom ashyo konsentratsiyasi, bufer almashinuvi, tuzlar va kichik{0}}molekulali aralashmalarni olib tashlash uchun ishlatiladi. Ajratish membranani saralash asosida amalga oshiriladi: monoklonal antikorlar (mAbs) kabi yirik molekulalar membranada saqlanadi, tuzlar, endotoksinlar, erkin xost hujayra oqsillari (HCP) va boshqa kichik{2}}molekulali aralashmalar membrana orqali o'tadi va o'tkazuvchanlikda chiqariladi. Jarayon miqyosi-kengaytirilganda membrana orqali maqsadli protein yoʻqolishi osonlik bilan sodir boʻlishi mumkin, bu esa hosilni bevosita kamaytiradi va partiya xarajatlarini oshiradi. Ba'zi ish sharoitlarida oqsil o'tkazuvchanligida aniqlanishi mumkin, bu sizib chiqqan komponentlar buzilmagan maqsadli mAb, buzilgan/parchalangan agregatlar yoki xost hujayra oqsillari ekanligini tezda aniqlashni talab qiladi. Ushbu maqola ikkita asosiy qismga bo'lingan: u an'anaviy jarayonlarni boshqarish yondashuvlarini ko'rib chiqadi va Tajribalar Dizayni (DOE) bilan birgalikda o'tkazuvchanlikda aniqlangan oqsillarning identifikatorini aniqlash uchun bir nechta tahliliy usullar bilan qo'llab-quvvatlanadigan mustahkam jarayon oynasini o'rnatadi.

 

 

I. UF/DF jarayonida maqsadli oqsilning membrana orqali o‘tishining asosiy sabablari

1. Haddan tashqari transmembran bosimi (TMP)
Membranada bosim farqi juda yuqori bo'lsa, erituvchining qarshiligi kuchayadi, bu esa monomerik oqsilni o'tkazuvchanlikka majbur qiladi. Masshtab{1}}ko‘tarilayotganda, oziqlantirish idishida katta hajmdagi materiallar mavjud va quvurlardagi bosimning o‘zgarishi aniqroq bo‘ladi, bu esa laboratoriya shkalasiga qaraganda vaqtinchalik ortiqcha bosimni oshiradi.

2. Noto'g'ri tangensial oqim tezligi
Agar oqim tezligi juda past bo'lsa, membrana yuzasida zich kontsentratsiya{0}}polyarizatsiya qatlami hosil bo'ladi va mahalliy oqsil kontsentratsiyasi membrananing bardoshlik chegarasidan oshib ketishi mumkin. Agar oqim tezligi juda yuqori bo'lsa, kesish stressi mAb ning strukturaviy bo'linishiga olib kelishi mumkin, bu esa membrana teshiklaridan erkin o'tishi mumkin bo'lgan kichikroq protein bo'laklarini hosil qiladi.

3. Xomashyoda oqsilning haddan tashqari yuqori konsentratsiyasi
Ozuqadagi oqsil kontsentratsiyasi juda yuqori bo'lsa, oqsil membrana yuzasida to'planadi va ba'zi monomerik oqsillar permeatga o'tishi mumkin. Bu keng ko'lamli{1}}ishlab chiqarishda keng tarqalgan muammo.

4. pH yoki jarayon doirasidan tashqarida o'tkazuvchanlik
Proteinning zaryad xususiyatlarining o'zgarishi uning hidratsiya radiusini va ko'rinadigan zarracha hajmini kamaytirishi mumkin, bu esa membrananing anormal o'tkazuvchanligiga olib keladi.

5. Membran kassetasining qarishi, yuqori diffuziv oqim yoki yetarlicha konditsioner-.
Membran kassetasidagi jismoniy nuqsonlar bevosita oqsil oqishiga olib kelishi va uskuna bilan bog'liq xavf-bo'lishi mumkin. Kuchli gidroksidi eritmalar bilan takrorlangan CIP asta-sekin polietersulfon (PES) membrana materialiga zarar etkazishi mumkin.

6. Haddan tashqari diafiltratsiya hajmi
Uzoq muddatli diafiltratsiya paytida erituvchining doimiy yuvilishi monomerik oqsilning oz miqdorini asta-sekin olib tashlashi mumkin.

 

II. Maqsadli protein o'tkazuvchanligi va yo'qolishining oldini olish bo'yicha an'anaviy amaliy chora-tadbirlar

(A) Jarayon parametrlarini boshqarish

1. Transmembran bosimini boshqarish (TMP)
Yuqori bosim haqida ogohlantirish chegarasini belgilang va membrana qatlamiga vaqtinchalik yuqori bosim ta'sirini oldini olish uchun blokirovka signallarini o'rnating. Kichik o'lchamdagi asosiy parametrlarni aniqlagandan so'ng, ishlab chiqarish hajmini oshirish- jarayonida xavfsiz ish bosimini pasaytiring va tegishli jarayon bardoshlik oralig'ini saqlang.

2. O'zaro oqim tezligini optimallashtirish
Barqaror chegara qatlamini o'rnating va o'zaro oqim orqali membrana yuzasida kontsentratsiyaning polarizatsiyasini kamaytiring, shu bilan manbada membrana yuzasida oqsil to'planishini minimallashtiring.

3. Konsentratsiyadan keyin yakuniy konsentratsiyani cheklash
Proteinning fizik-kimyoviy xususiyatlariga asoslangan konsentratsiya chegarasini belgilang va ortiqcha ozuqa konsentratsiyasidan saqlaning. mAblar uchun odatiy yakuniy konsentratsiya odatda 50 mg/ml dan oshmaydi; agregatsiyaga moyil mAblar- uchun konsentratsiyani yanada kamaytirish kerak.

4. Oziqlantirishning pH va o'tkazuvchanligini nazorat qilish
Proteinning barqaror gidratlangan zarracha hajmini saqlang va kislota/asos yoki ion quvvatining buzilishi-bilan molekulyar qisqarishdan saqlaning.

(B) Uskunalar va boshqaruv elementlari

1. Har bir partiyadan oldin membrana kassetasining yaxlitligi sinovini o'tkazing
Singan membrana tolalarini aniqlash uchun har bir partiyani ishlab chiqarishdan oldin pufakcha{0}}nuqta sinovini o'tkazing. Proteinning uzluksiz oqishi oldini olish uchun shikastlangan membrana kassetalarini zudlik bilan tashlash kerak.

2. CIP tozalash tartibini standartlashtirish
NaOH kontsentratsiyasini va aloqa vaqtini nazorat qiling. Kuchli gidroksidi tozalashdan so'ng, membrana gözenek deformatsiyasi xavfini kamaytirish uchun membrana materialini to'liq muvozanatlashtiring.

3. Bosqichli diafiltratsiyadan foydalaning
Tuzlarni olib tashlash uchun dastlabki bosqichda-katta hajmli bufer almashinuvidan foydalaning va oxirgi nuqta yaqinlashganda diafiltratsiya oqimi tezligini sekinlashtirib, oqsilning tortilishi va yoʻqotilishini kamaytiradi.

 

III. DOE orqali jarayonni loyihalash maydonini yaratish (QbD jarayonini tavsiflash; IND topshirish uchun amal qiladi)

1. Faktorli skrining
Ekranning beshta asosiy UF/DF jarayoni parametrlari (P): transmembran bosimi, ozuqa oqimi tezligi, dastlabki protein konsentratsiyasi, ozuqa pH va ish harorati.
Javob o‘zgaruvchilari: saqlanib qolgan hosil, o‘tkazuvchanlik tarkibidagi oqsil miqdori, membrana oqimi va yuqori{0}}molekulyar-agregatlarning foizi.

Muhimlikni tahlil qilish orqali oqsil sızıntısına yordam beradigan asosiy omillarni aniqlang.

2. Javob sirtini modellashtirish
Javob yuzasini yaratish va parametrlar orasidagi o'zaro ta'sirlarni tahlil qilish uchun eng katta ahamiyatga ega bo'lgan to'rtta parametrni tanlang. Ko'pgina ish sharoitlarida bitta parametr o'zining malakali diapazonida qolishi mumkin, ikkita parametrning kombinatsiyasi oqsilning o'tishiga olib kelishi mumkin. Bunday o'zaro ta'sirlarni an'anaviy{2}}bir omil-bir vaqtning o'zida--o'tkazish orqali aniqlash mumkin emas. Modelga asoslanib, ishlaydigan dizayn maydonini aniqlang. Jarayon parametrlari ushbu diapazonda qolar ekan, aralashmalar diafiltratsiya yo'li bilan olib tashlanishi bilan oqsillarni samarali ushlab turishni ta'minlash mumkin.

3. Eng yomon{1}}holatlar (jarayonni tavsiflash uchun talab qilinadi)
Ishlab chiqarishning o'zgaruvchanligini taqlid qilish uchun operatsion chegaralarning chegaralarida jarayon parametrlarini tanlang: maksimal TMP, minimal o'zaro oqim tezligi va yuqori-protein kontsentratsiyasining chegarasi. Ekstremal ish sharoitlarida ham katta{2}}miqyosda maqsadli protein yo'qotilmasligini va bu CMC tekshiruvi talablariga javob berishini tasdiqlang.

 

IV. O'tkazuvchanlikda aniqlangan oqsillarni aniqlash va maqsadli mAb, parchalanish fragmentlari va HCP ni ajratish uchun bir nechta tahliliy usullar

Analitik samaradorlik, xarajat va normativ hujjatlarni taqdim etish stsenariylariga asoslanib, usullarni ikki toifaga bo'lish mumkin: tezkor skrining va tasdiqlovchi test. Jarayonni muntazam monitoring qilish uchun tezkor usullarga ustunlik berish kerak; g'ayritabiiy og'ishlar yuzaga kelganda, aniq identifikatsiyalash usullaridan foydalanish kerak.

1. UV spektrofotometriyasi (tezkor onlayn skrining; oddiy doʻkon-pol monitoringi uchun afzal)
Permeatni yig'ing va uning A280 absorbsiyasini o'lchang. Bu faqat o'tkazuvchanlikda oqsil mavjudligini aniqlashi mumkin va oqsil turlarini ajrata olmaydi. U asosan jarayonni muntazam monitoring qilish uchun ishlatiladi. Doimiy ravishda ortib borayotgan A280 qiymati oqsil oqishi yomonlashganini ko'rsatadi va diafiltratsiyani darhol to'xtatib turish va jarayonni tekshirishni talab qiladi.

2. SDS-PAGE elektroforezi (eng koʻp qoʻllaniladigan sifatli identifikatsiya usuli)
Qaytaruvchi va kamaytiruvchi{0}}elektroforezdan foydalaning va tarmoqli pozitsiyalarini xom ashyodagi maqsadli mAb bilan solishtiring:
1) Agar tarmoqli joylashuvi maqsadli mAb ga to'liq mos kelsa, buzilmagan mAb membranadan o'tgan.
2) Agar quyi{1}}molekulyar{2}}bo‘laklar paydo bo‘lsa, oqsil gidrolitik parchalanib, mAb bo‘laklarini hosil qiladi.
3) Agar bantlar bir nechta turli bantlar bilan tarqoq bo'lsa, ularning aksariyati maqsadli mahsulotdan ko'ra E. coli/CHO xost hujayralaridan olingan xost hujayra oqsillari (HCPs).

3. Yuqori-samaradorlik-xromatografiyasi (HPSEC)
Komponentlarni molekulyar o'lchamiga ko'ra ajratib oling va ularning elutsiya vaqtini xom ashyo xromatogrammasining vaqti bilan solishtiring:
- mAb bilan bir xil ushlab turish vaqtiga ega boʻlgan asosiy choʻqqi maqsadli oqsilning buzilmaganligini bildiradi.
- Ilgari elutsiya cho‘qqisi yuqori-molekulyar{2}}agregatlar/parchalar ekanligini ko‘rsatadi.
- Elutsiyaning keyinroq cho‘qqisi past-molekulyar-og‘irlikdagi parchalanish fragmentlarini ko‘rsatadi.
- Xarakterli asosiy tepalikning yo'qligi HCP aralashma oqsillarini ko'rsatadi.
Ushbu usul miqdoriy ma'lumotlarni taqdim etishi mumkin va jarayonning og'ishini tekshirish hisobotlariga kiritilishi mumkin; u klinik topshirish materiallarida yuqori qabul qilinadi.

4. HCP xost-hujayra oqsili ELISA to'plami testi
Agar o'tkazuvchanlikda oqsil aniqlansa, Elishay natijasi oshadi va HPSEC xarakterli mAb cho'qqisini ko'rsatmasa, sizib chiqqan material asosan CHO xost{0}}hujayra oqsillari ekanligini aniqlash mumkin. Bu yuqori oqimni tozalash vaqtida nopoklikni to'liq yo'q qilishni ko'rsatadi; aralashmalar UF/DF bosqichida yuviladi va mahsulot yo'qotilishini anglatmaydi.

5. Yaqinlik xromatografiyasini tekshirish (protein A xromatografiyasi)
Protein A mAblarning Fc mintaqasini maxsus bog'laydi. Permeat namunasini ustunga yuklang: xarakterli elyusiya cho'qqisining ko'rinishi buzilmagan maqsadli antikor mavjudligini ko'rsatadi; elutsiya cho'qqisining yo'qligi permeat tarkibidagi oqsillarning barcha nopoklik oqsillari ekanligini ko'rsatadi.

6. Mass-spektrometriya (LC{1}}MS) (-chuqurlikdagi kuzatuv; asosiy jarayon og‘ishlarini tekshirish uchun ishlatiladi)
LC-MS aminokislotalar ketma-ketligini bevosita tahlil qilishi va oqsilning kelib chiqishini aniq aniqlashi mumkin. U asosan qiyin yoki g'ayrioddiy og'ishlarni tekshirishda qo'llaniladi va jarayonni nazorat qilish testida muntazam-qo'llanilmaydi.

V. Turli tahliliy natijalarga mos keladigan tuzatuvchi harakatlar

1. O'tkazuvchanlikda aniqlanmagan maqsadli mAb
Transmembran bosimini va konsentratsiyadan keyin yakuniy kontsentratsiyani kamaytiring; DOE natijalari asosida jarayonning ishlash diapazonini toraytiring; va membrana kassetasining yaxlitligini tekshiring.

2. Permeatda aniqlangan antikor degradatsiyasi bo'laklari
Jarayon davomida kesish stressini va pH ekstremalligini o'rganing; oqsil parchalanishini kamaytirish uchun yuqori oqimdagi virusni inaktivatsiya qilish bosqichini optimallashtirish.

3. Permeatda aniqlangan faqat HCP nopoklik oqsillari
UF/DF parametrlarini sozlash talab qilinmaydi. Muammoni oldingi xromatografiya bosqichlariga qaytaring va yaqinlik va ion almashish xromatografiyasi- jarayonida kirlarni olib tashlashni yaxshilang.

 

VI. Xulosa

UF/DF vaqtida oqsil sızıntısının oldini olish uchun an'anaviy jarayon nazorati faqat barqaror kichik-miqyosdagi ishlab chiqarishni etarli darajada hal qila oladigan individual nuqta parametrlarini aniqlashda tarixiy tajribaga tayanadi. Jarayonni bosqichma-bosqich oshirishda barqaror ishlashni ta'minlash uchun{2}}bosqichma-bosqich ko'lamini oshirish uchun jarayonni loyihalash maydonini etarli darajada bardoshlik bilan yaratish uchun DOE-ga ​​asoslangan jarayon tavsifidan foydalanish kerak. Intervalga{5}}asoslangan parametr nazorati ishlab chiqarish oʻzgaruvchanligini qoplashi mumkin. Protein o'tkazuvchanligida aniqlangandan so'ng, oddiy ultrabinafsha nurlanishni aniqlash tizimi dastlabki ogohlantirishni ta'minlaydi, keyin elektroforez, HPSEC va Elishay izlenebilirlik va identifikatsiya qilish uchun. Bu maqsadli mahsulot va xost{8}}hujayra aralashmalari oʻrtasida aniq farqlash imkonini beradi, bu esa maqsadli ildiz-sabablarini tekshirish va tuzatish choralarini koʻrish imkonini beradi. Bu ayni paytda mAb loyihalari uchun CMC hujjatlariga kiritilgan standartlashtirilgan tadqiqot komponentidir.