Rekombinant Escherichia Coli ning yuqori zichlikdagi fermentatsiya lizatini tushuntirish jarayonini o'rganish

 

Moddiy suyuqlikning xromatografiyaga aralashuvini kamaytirish va maqsadli oqsilning tiklanishini yaxshilash uchun rekombinant Escherichia coli ning ikkita shtammining yuqori zichlikdagi fermentatsiya lizatini aniqlash jarayoni o'rganildi. Streptococcus suis va Haemophilus parasuisning asosiy genlarini ifodalovchi BL21-HP1036 va BL21-palA shtammlari tanlangan. Protein hosildorligini loyqalik va elektroforezni aniqlash orqali baholash uchun tangensial oqim jarayoni, yuqori tezlikda santrifüjlash jarayoni va membrana kassetasini tozalash jarayoni ishlatilgan.

 

Natijalar shuni ko'rsatdiki, Streptococcus suis va Haemophilus parasuisning asosiy genlarini ifodalovchi BL21-HP1036, BL{2}}palA yuqori zichlikdagi fermentatsiya lizati membrana kassetasini filtrlash va santrifüjlash orqali aniqlangan va oqsil hosildorligi 80% dan ortiq, Bu xromatografik shovqinni samarali ravishda kamaytiradi va tiklanish tezligini oshiradi.

 

Kirish

Hozirgi vaqtda cho'chqachilik xo'jaliklarida Streptococcus suis (SS) va Haemophilus parasuis (HPS) eng keng tarqalgan bakterial kasallikning qo'zg'atuvchisi bo'lib, cho'chqachilik sanoatiga katta zarar keltiradi. SS jami 35 ta serotipga bo'linishi mumkin 1-34 va 1/2, HPS esa 1-15 serotiplarga bo'linishi mumkin va ikkalasi ko'pincha aralashtiriladi, asosan cho'chqa poliseroziti, artrit, meningit, endokarditni keltirib chiqaradi. , bakterial septitsemiya va bronxit.

 

Streptococcus suis va Haemophilus parasuis serotiplarining ko'pligi tufayli turli xil serotiplar o'rtasidagi o'zaro himoya zaif va antibiotiklar bilan davolashda antibiotiklarga qarshilik sezilarli darajada oshadi, bu terapevtik ta'sirga ta'sir qiladi.

 

Vaktsinalar SS va HPS ning oldini olishning samarali vositalaridan biriga aylandi. Inaktivatsiyalangan vaktsinalar, zaiflashtirilgan vaktsinalar, jonli vaktsinalar, subunit vaktsinalar va genetik muhandislik vaktsinalari mavjud, ammo inaktivatsiyalangan vaksinalar va zaiflashtirilgan vaktsinalar asosan bozorda mavjud va ularning immun himoyasi yaxshi, lekin o'zaro himoya aniq emas. Subunit vaktsina streptokokklarga qarshi yangi turdagi vaktsina bo'lib, kuchli o'zaro himoya va arzon narxga ega yangi vaktsina turidir. Streptococcus suis va Haemophilus parasuis subunit vaktsinalarini tadqiq qilish va ishlab chiqish Xitoyda cho'chqachilik sanoatini bezovta qiladigan Streptococcus suis va Haemophilus parasuisning oldini olish va nazorat qilish muammolariga mukammal yechim beradi.

 

Streptococcus suis va Haemophilus parasuis subunit vaktsinalari rekombinant Escherichia coli tomonidan yuqori zichlikdagi fermentatsiyaga duchor bo'ladi. Lizatning aniqlanishi maqsadli oqsillarning hosildorligiga katta ta'sir ko'rsatadi, ammo tegishli hisobotlar kam. Fermentatsiya va tozalash jarayonining aniqlik bosqichini qanday amalga oshirish muhim ishdir. Ushbu maqolada rekombinant E. coli BL21-HP1036, BL21-palA yuqori zichlikdagi fermentatsiya ob'ekt sifatida, tiniqlashtiruvchi eritmaning loyqaligini qanday samarali ravishda kamaytirishni o'rganish, oqsil hosildorligini oshirish, Streptococcus suis subunit vaktsina fermentatsiyasi jarayonini sanoat maydalash va tushuntirish texnologiyasiga erishish uchun nazariy asos va texnik yordam beradi.

 

1. Materiallar va usullar

1.1 Materiallar

 

1.1.1 Shtammlar

Streptococcus suis va Haemophilus parasuis shtammlari BL21-HP1036, BL{2}}pa-lA

 

1.1.2 Asosiy vositalar va reaktivlar

Xamirturush ekstrakti va cho'chqa go'shti; natriy xlorid; kanamitsin, IPTG; dan formaldegid; SDS-PAGE jel to'plami.

 

1.1.3 Asosiy sinov uskunalari

Yuqori zichlikdagi fermentator; Yuqori tezlikli santrifüj; elektroforez apparati; Ultraviyole jel tasvirlash tizimi; Ultrasonik maydalagich; Kichik yuqori tezlikda santrifüj; ultrabinafsha spektrofotometr; Doimiy haroratni chayqash stoli; Affinity xromatografiya uskunalari.

 

1.2 Usullar

 

1.2.1 Yuqori zichlikdagi fermentatsiya madaniyati

Malakali rekombinant koliform shtammlari BL21-HP1036 va BL{2}}pa-lA sintetik muhitda 2%(V/V) da emlangan va 35-40 soat davomida 37 darajada ekilgan.

 

1.2.2 Rekombinant oqsil bilan bog'liq ifoda

Fermentatsiya eritmasi OD{0}}±0.1 bo'lganda, induksiya boshlandi, induksiya harorati 35 daraja ± 0,5 daraja edi va 10 soatlik induksiyadan keyin madaniyat tugatildi.

 

1.2.3 Yuqori bosimli bir hil maydalash va santrifüjlash

Inaktivatsiya sinovidan o'tgan bakteriya suyuqligi 100 ~ 150 MPa bosim bilan mos ravishda hujayra yorilishi uchun yuqori bosimli gomogenizator tomonidan ezildi. Ezilgandan keyin ezilgan suyuqlik past haroratda saqlanadi.

Supernatant yuqori tezlikda, markazdan qochma tezligi: 15000 rpm, haroratni nazorat qilish: 10 ° ~ 15 daraja, in'ektsiya tezligi: 0,5 ~ 1 L/min, mos ravishda santrifüj orqali olingan, supernatant to'plangan va supernatant endotoksinni olib tashlaydigan idishlar bilan to'ldirilgan.

 

1.2.4 Mikrofiltratsiya membranasi kassetasini aniqlashtirish

Membrana bir yo'nalishda 10L tozalangan suv bilan yuvilib, tangensial oqim filtratsiyasi amalga oshirildi. Santrifüjdan so'ng 300 ml singan bakterial suspenziya quvur liniyasi santrifugasidan olindi va 0,45 um mikrofiltratsiyali membrana kassetasi bilan tozalandi. Loyqalik navbati bilan namuna olish yo‘li bilan o‘lchandi va santrifüjdan keyingi loyqalik, mikrofiltratsiya membranasi kassetasidagi tiniq suyuqlikning loyqaligi va mikrofiltratsiya membranasi kassetasidagi konsentrlangan suyuqlikning loyqaligi solishtirildi. Protein hosildorligini baholash uchun namunadagi oqsil miqdori xromatografiya va elektroforez yordamida aniqlandi.

 

2-qadam: Natijalar

2.1 BL{2}}HP1036 va BL21-palA oqsilining aniqlik ma'lumotlari va sinov natijalari

Natijalar FIG. 1 BL{1}}HP1036 va BL21-palA rekombinant Escherichia coli maydalagich suyuqligining loyqaligi 4 500 NTU va 4 000 NTU dan mos ravishda 1970 NTU va 520 NTU gacha kamayganligini ko'rsatadi. kolba santrifugasidan keyin. BL{8}}HP1036 va BL{10}}palA rekombinant Escherichia coli ning loyqaligi mikrofiltratsiya membranasi kassetali usuli bilan 25 NTU va 1,28 NTU ga tushirildi. Ko'rinib turibdiki, mikrofiltratsiya membranasi kassetasining tangensial oqim filtratsiyasi va optimallashtirilgan ochiq oqim kanalidan foydalanish an'anaviy santrifüj filtrlashdan ko'ra endotoksin, viskozite va xromatografik suyuqlikning loyqaligini kamaytirishga yaxshi ta'sir qiladi va singan rekombinant E. coli heteroproteinini sezilarli darajada kamaytirishi mumkin. va nuklein kislota.

 

2.2 BL{2}}HP1036 va BL21-palA namunalarida oqsillarni qayta tiklash

1-jadvalda rekombinant Escherichia coli BL21-HP1036 oqsili mikrofiltratsiya bilan tiniqlangan eritmada ham, mikrofiltratsiya membranasi bilan qoplangan konsentrlangan supernatantda ham mavjudligi va oqsilni mikrofiltratsiya bilan tiniqlangan eritmadan va konsentrlangan supernatantdan olingandan so‘ng umumiy oqsil hosildorligi ko‘rsatilgan. taxminan 88,5% ni tashkil qiladi. BL{5}}palA oqsili tiniqlangan mikrofiltratsiya ekssudati eritmasida va mikrofiltratsiya membranasi kassetasi bilan qoplangan konsentrlangan eritmaning supernatantida ham mavjud edi. BL{6}}PALa oqsilining umumiy hosildorligi 81,5% ni tashkil etdi.

 

3. Xulosa

Ushbu maqolada Streptococcus suis va Haemophilus parasuisning BL{0}}HP1036 va BL{2}}palA asosiy genlarini ifodalovchi shtammlar yuqori zichlikdagi fermentatsiyadan oʻtdi va 0,45 dan oʻtdi. um mikrofiltratsiya membranasi kassetasi jarayoni bilan sezilarli darajada kamaytirildi, bu mikrofiltratsiya membranasi kassetasi bilan tangensial oqim filtrlash texnologiyasi yuqori tezlikda santrifüjga qaraganda yaxshiroq ekanligini va buzilgan rekombinant Escherichia coli ning nopoklik oqsilini va nuklein kislotasini sezilarli darajada kamaytirishi mumkinligini ko'rsatadi.

 

Yagona mikrofiltratsiya membranasi kassetasida shaffof suyuqlik yig'ilgandan so'ng, 62,9% BL21-HP1036 maqsadli oqsilining 37,1% mikrofiltratsiya konsentrati yoki mikrofiltratsiya membranasi kassetasida va boshqa yo'qotishlar mavjud edi. , aniqlashtirish uchun ikki bosqichli usul qabul qilindi. Birinchi bosqichda ekssudatni aniqlashtirish va to'plash uchun 0,45um mikrofiltratsiyali membrana kassetasi ishlatilgan; ikkinchi bosqichda qolgan konsentrlangan suyuqlik kolba santrifüjlashdan keyin yig'ildi va ikki bosqichli tiniq suyuqlik xromatografik namuna sifatida birlashtirildi BL21-palA fermentatsiya suyuqligining loyqalik qiymati sezilarli darajada oshmadi, oqsil unumiga erishish mumkin edi. 85,5% dan ortiq va BL{12}}Pala fermentatsiya suyuqligining oqsil unumi ikki bosqichli davolashdan keyin 81,5% ga yetishi mumkin.

 

Mikrofiltratsiya membranasi kassetasini qanday tanlashga kelsak, Guidling Technology sizga yuqori sifatli echimlarni taqdim etishi mumkin. Bizning mikrofiltratsiya membrana kassetasi va ultrafiltratsiya membrana kassetali seriyali mahsulotlarimiz biotexnologiya uchun maxsus ishlab chiqilgan tashuvchi sifatida polieter sulfondan foydalanadi. Bizning polieter sulfon membranamiz yuqori o'tkazuvchanlik, past protein adsorbsiyasi, yuqori mexanik kuch, zarba qarshiligi va boshqalarning afzalliklariga ega. Biz sizga real vaqtda kirish va chiqish bosimini o'lchash uchun maxsus membrana qisqichlari bilan ta'minlaymiz va maxsus ultrafiltratsiya / mikrofiltratsiya tizimini sozlash uchun sizning ehtiyojlaringizga ko'ra texnik tashriflarni ta'minlay olamiz. Bunday kichik tangensial oqim tizimi kichik, uchuvchi va kichik hajmdagi ishlab chiqarish uchun ishlatilishi mumkin va sinov talablari va ishlab chiqarish talablariga to'liq javob berish uchun to'liq chiziqli kuchaytirilishi mumkin.

Guidling haqida

Guidling Technology - bu biofarmatsevtika, hujayra madaniyati, biomeditsinani tozalash va konsentratsiyalash, diagnostika va sanoat suyuqliklariga qaratilgan milliy yuqori texnologiyali korxona. Biz santrifüj filtr qurilmalari, ultrafiltratsiya va mikrofiltratsiya kassetalari, virus filtri, TFF tizimi, chuqurlik filtri, ichi bo'sh tolalar va boshqalarni muvaffaqiyatli ishlab chiqdik. Ular biofarmatsevtika, hujayra madaniyati va boshqalarni qo'llash stsenariylariga to'liq javob beradi. Bizning membranalarimiz va membrana filtrlarimiz konsentratsiya, ekstraktsiya va oldindan filtrlash, mikrofiltratsiya, ultrafiltratsiya va nanofiltratsiyani ajratishda keng qo'llaniladi. Kichik, bir martalik laboratoriya filtrlashdan ishlab chiqarish filtrlash tizimlariga, sterillik sinovlari, fermentatsiya, hujayra madaniyati va boshqalarga qadar ko'plab mahsulot liniyalarimiz sinov va ishlab chiqarish ehtiyojlarini qondiradi. Guidling Technology siz bilan hamkorlik qilishni intiqlik bilan kutmoqda!