Membran texnologiyasi va vaktsinani tushuntirish (Ⅰ)
Vaktsinalar turli manbalardan, jumladan, to'qima ekstraktlari, bakterial hujayralar, virusli zarralar, oqsillar va sutemizuvchilarning rekombinant hujayralari, xamirturush va hasharotlar hujayralari tomonidan ishlab chiqarilgan nuklein kislotalardan keladi.
Vaktsina ishlab chiqarishning eng keng tarqalgan usuli dastlabki fermentatsiya jarayoniga, so'ngra tozalashga asoslangan. Vaktsina ishlab chiqarish juda ko'p turli bosqichlar va jarayonlarni o'z ichiga olgan murakkab jarayondir. To'g'ri tozalash usulini tanlash istalgan yakuniy mahsulot tozaligiga erishish uchun juda muhimdir. Vaktsinalarni aniqlashtirish muhim qadam bo'lib, mahsulotni qayta tiklashga va keyinchalik quyi oqimlarni tozalashga sezilarli ta'sir ko'rsatadi. Vaktsinalarni aniqlashtirish uchun bir nechta usullardan foydalanish mumkin. Yig'ish usuli va uskunani tanlash akkumulyator turiga, yig'ilayotgan mahsulotning tabiatiga va texnologik suyuqlikka bog'liq. Bu usullarga membranali filtrlash (mikrofiltratsiya, tangensial oqim filtratsiyasi), sentrifugalash va chuqur filtrlash (normal oqim filtratsiyasi) kiradi. Ko'p yillik tajribaga ko'ra, vaktsina hosilini aniqlashtirish odatda sentrifugalash va chuqur filtrlash orqali amalga oshiriladi.
So'nggi yillarda vaktsinalarni tushuntirishda membrana asosidagi usullar mashhurlikka erishdi. Yuqori oqim jarayonlari bir martalik texnologiyalardan tobora ko'proq foydalanmoqda, shuning uchun hosilni yig'ish strategiyasi o'zgarishi kerak. Ushbu maqolada turli xil membranaviy texnologiyalar va ularning vaktsinalarni tushuntirishda qo'llanilishi haqida to'liq ma'lumot berilgan.
01 Kirish
Vaktsinalar o'limning dahshatli sababi bo'lib qoladigan yuqumli kasalliklarning oldini olishning muhim tarkibiy qismidir. Emlash tufayli har yili 2 milliondan 3 milliongacha odam difteriya, qoqshol, ko'k yo'tal va qizamiqdan xalos bo'ladi. Vaktsinalar kichik rekombinant oqsillardan butun virus zarralari va butun bakteriyalargacha bo'lgan keng doirani qamrab oladi. Ular turli tizimlar tomonidan ishlab chiqarilishi mumkin: tuxum, sutemizuvchilar hujayralari, bakteriyalar va boshqalar. Vaktsinalarning murakkabligi va xilma-xilligi tufayli vaktsina platformalariga qiziqish ortib borayotganiga qaramay, hozirda asosiy tozalash protokoli yoki shablonlari mavjud emas.
Odatda, vaktsina jarayonini uch qismga bo'lish mumkin: yuqori oqim (ishlab chiqarish va tushuntirish), quyi oqim (tozalash, shu jumladan ultrafiltratsiya, xromatografiya va kimyoviy tozalash) va shakllantirish (yakuniy to'ldirish operatsiyalari). Ishlab chiqarish tizimidan mustaqil ravishda, aniqlik (keraksiz moddalarni dastlabki olib tashlash) mustahkam tozalash jarayonini aniqlashda asosiy rol o'ynaydi. To'g'ri tushuntirish bosqichi quyi oqimdagi ishlov berish yukini kamaytirish uchun asosan butun hujayralarni, hujayra qoldiqlarini, kolloidlarni va katta agregatlarni olib tashlaydi. Ba'zi hollarda tushuntirish erimaydigan aralashmalarni, xost hujayra oqsillarini (HCP) va hujayra nuklein kislotalarini ham kamaytirishi mumkin. Boshqa har qanday tozalash bosqichi singari, aniqlashtirish bosqichi vaktsinaning o'ziga xosligi va ishlab chiqarish cheklovlariga moslashgan holda maksimal mahsulot rentabelligi va tozaligiga erishish uchun optimallashtirilishi kerak.
Vaktsina turlarining heterojenligi tufayli aniqlashtirish uchun turli usullar, jumladan, santrifüjlash yoki filtrlash qo'llaniladi (1-jadval).
Istalgan aniqlikka erishish uchun odatda bir nechta operatsiyalar ketma-ketligi talab qilinadi. Birinchi operatsiya kattaroq zarrachalarni olib tashlash uchun mo'ljallangan (birlamchi aniqlashtirish) va ikkinchi operatsiya kolloidlar va boshqa sub-mikron zarralarini olib tashlash uchun mo'ljallangan (ikkilamchi aniqlashtirish). Past tezlikda santrifüjlash bir martalik aniqlovchi variant bo'lib xizmat qiladi, bu hujayralar va hujayra qoldiqlarini yog'ingarchilik bilan olib tashlashga imkon beradi. Santrifüjlash yuqori qattiq yuklarga bardosh bera oladi va ommaviy yoki doimiy rejimda va diskli santrifüjlarda keng qo'llaniladi. Bu katta kapital qo'yilmalarni va texnik xizmat ko'rsatish xarajatlarini talab qiladi va ishonchli pasaytirish modeli yo'qligi sababli masshtabni kengaytirishda qiyinchiliklarga duch keladi. Biroq, ba'zi tijorat vaktsina ishlab chiqaruvchilari yuqori qayta ishlash hajmi va ko'proq ishlab chiqarish faoliyatini o'z ichiga olgan keng ko'lamli ishlab chiqarishda sentrifugalardan foydalanadilar.
Aniq filtrlash oddiy oqim filtratsiyasi (NFF, shuningdek, o'lik filtrlash deb ham ataladi) yoki tangensial oqim filtratsiyasi (TFF, o'zaro oqim filtrlash deb ham ataladi) orqali amalga oshirilishi mumkin. Shuningdek, musbat zaryadlangan materiallar va hujayra qoldiqlari, kolloidlar va manfiy zaryadlangan kiruvchi komponentlarning saqlanishini kuchaytiruvchi OITSni filtrlaydigan maxsus filtr rejimlari (chuqur filtrlar) mavjud.
Membran filtrlari zarrachalarni o'lchamiga qarab ushlab turadi va yuqori axloqsizlikni ushlab turish qobiliyatiga ega emas, shuning uchun ular ikkilamchi tozalash bosqichlari uchun javob beradi. Ham chuqur filtrlar, ham membranali filtrlarni o'lchash va amalga oshirish oson (oddiy tizim dizayni). NFFdan farqli o'laroq, TFF asosan birlamchi tushuntirish (mikrofiltratsiya) uchun ishlatiladi. Kesish diapazoni 0.1-0.65 mkm bo'lgan membranalar (afzalroq ochiq kanal bilan) hujayralarni, hujayra qoldiqlarini va boshqa katta ifloslantiruvchi moddalarni saqlash uchun muvaffaqiyatli ishlatilgan. Ko'pgina TFF uskunalari chiziqli ravishda kengaytirilishi mumkin va tozalashdan keyin qayta foydalanish mumkin, bu qadam uchun sarflanadigan materiallarning narxini sezilarli darajada kamaytiradi.
Aniqlash bosqichi yuqori va quyi oqim jarayonlari o'rtasida bo'ladi va vaktsina jarayonini ishlab chiqishda ba'zan e'tibordan chetda qoladi, chunki vaqt va resurslar xromatografiya yoki zichlik gradienti santrifüjlash kabi boshqa tozalash bosqichlari uchun ustuvor hisoblanadi.
Vaktsina ishlab chiqarish jarayonlari uchun patentlar ham ko'pincha tushuntirish bosqichini o'tkazib yuboradi. Aniqlash samaradorligi quyi oqim jarayonining ishlashiga bevosita ta'sir qiladi. Noto'g'ri optimallashtirilgan tushuntirish bosqichi sterillangan filtrning sig'imiga salbiy ta'sir ko'rsatishi yoki xromatografik qatronning xizmat qilish muddatini qisqartirishi mumkin. Bugungi kunda tartibga solishning qattiqroq talablari vaktsina ishlab chiqaruvchilarni toza, yaxshi tavsiflangan, ammo arzonroq vaktsinalarni ishlab chiqarishga majbur qiladi. Bunday holda, har bir qadamga munosib e'tibor berilishi kerak. Mavjud tendentsiyalar shuni ko'rsatadiki, yuqori oqim jarayoni mahsuldorligi va yuqori hujayra zichligi bilan "tozaroq" ekspressiya tizimiga (ya'ni sarumsiz muhitda o'stirilgan hujayralar tuxum o'rnini bosadi) harakat qilmoqda.
Yakuniy mahsulotning tozaligini oshirish uchun quyi oqimdagi tozalash jarayonlari soddalashtiriladi va soddalashtiriladi. Ushbu o'zgarishlarni hal qilish uchun tushuntirish bosqichi muammoga aylanmaydi. Bunday holda, filtrlash texnologiyasi jarayonning moslashuvchanligini oshirish, bir martalik foydalanish imkoniyati va investitsiya xarajatlarini kamaytirish masalalarini hal qiluvchi yangi tushuntirish muammosiga javob beradi.
02 Virusga qarshi vaktsinalarni tushuntirish
Vaktsinalarning ozuqa oxirida hosilni aniqlashtirish uchun bir necha turdagi tushuntirish usullari, yakka tartibda yoki kombinatsiyada muvaffaqiyatli qo'llanilgan.
Pilot shkalasi:1-20L, ishlab chiqarish miqyosi: 20L dan ortiq
2.1 Virusga qarshi vaktsinalarni tushuntirish uchun ehtiyot choralari
Ko'pgina vaktsinalar virusli infektsiyaga qarshi immunitetni shakllantirish uchun virus zarralarining to'liq yoki bir qismini o'z ichiga oladi. Ular odatda to'rtta keng toifaga bo'linadi:
Virusning virulentligini kamaytirish uchun zaiflashtirilgan shtammga asoslangan jonli zaiflashtirilgan vaktsina (LAV). Attenuatsiyalangan viruslar organizmda ko'payishi mumkin, ammo patogen emas.
- infektsiyani yo'q qilish uchun kimyoviy yoki ultrabinafsha inaktivlangan viruslarni o'z ichiga olgan faollashtirilgan virus (IV) vaktsinalari. Virus zarralari to'liq, bo'lingan yoki tozalangan bo'lishi mumkin (faqat antigenik oqsillar).
- Virusli vektor (VV) vaktsinasi patogen virusning antijenini taqdim qiluvchi faol, patogen bo'lmagan virusdir. Yaqinda ishlab chiqilgan ushbu tuzilmalar gen terapiyasi dasturlari uchun ham qo'llaniladi.
Virusga o'xshash zarrachalar (VLPs) vaktsinalari, virusli zarrachalarning umumiy tuzilishini taqlid qiluvchi, ammo yuqumli genetik materialni o'z ichiga olmaydi, virusli subunit vaktsinalarining o'ziga xos klassi.
Aksariyat hollarda virus zarralari aniqlashtirish bosqichida, hatto virusli vaktsina lizis paytida ham to'liq saqlanib qoladi (ajralish odatda quyi oqimda, tozalangan muhitda amalga oshiriladi).
Virusni aniqlashtirishning asosiy muammosi hujayra qoldiqlarini, katta agregatlarni va erimaydigan ifloslantiruvchi moddalarni samarali olib tashlashda yuqori rentabellikdagi virus zarralarini tiklashdir. Keyingi bo'limlarda ta'riflanganidek, virusning buzilishi yoki yo'qolishiga olib keladigan bir qancha omillar mavjud. Bundan tashqari, virusli hosildorlikka tayanish qiyin bo'lishi mumkin, chunki jarayonning ushbu bosqichida, ayniqsa LAV va VV vaktsinalari uchun virus miqdoriy tahlil usullarining yuqori o'zgaruvchanligi. Ushbu vaktsinalar uchun virus hosildorligi ko'pincha blyashka testi yoki TCID 50 testi kabi infektsion testlar yordamida baholanadi. Yig'ilgan birikmalarning ba'zilari virusning ko'rsatuvchi hujayralarni yuqtirish qobiliyatiga xalaqit berishi mumkinligi ushbu miqdoriy yondashuvning o'zgaruvchanligini oshiradi.
2.2 Virusga qarshi vaktsinalarni tushuntirish strategiyasi
Virusli vaktsinalar hajmi, tuzilishi, shakli va ekspression tizimlarida juda farq qiladi (3-jadval).
Natijada, uning quyi oqim jarayonlari, xususan, tushuntirish bosqichlari uchun odatda shablon mavjud emas. Nazariy jihatdan, virusni aniqlashtirish uchun barcha mavjud texnikalar (past tezlikda santrifüjlash, mikrofiltratsiya TFF, NFF) tanlanishi va potentsial ravishda birlashtirilishi mumkin. Darhaqiqat, tushuntirish usullarining muvaffaqiyatiga ekspressiya tizimi va ishtirok etgan viruslarning fizik-kimyoviy xususiyatlari ta'sir qiladi.
Recently, the high cell density process of viral vaccines is being explored. High cell density processes add to the challenge of clarification. Many treatment methods are by preconditioning, i.e. polymer-induced flocculation, precipitation, alternating TFF, etc. For example, Tomic et al. describe a method for high cell density collection (>{0}} hujayralar /ml) katyonik polimerlardan foydalangan holda tozalash usuli an'anaviy usullarga nisbatan chuqur filtrlash maydonini 4 marta qisqartirdi. Ushbu texnika santrifugalarsiz katta quvvatli fermentatorlarni yig'ish imkonini beradi. Xuddi shunday, Riske va boshqalar. 1.4-2,6% qattiq moddalarni o'z ichiga olgan 40 L hujayra madaniyatini (0,02%) xitozan bilan davolash chuqur filtrlashdan keyin mutlaq filtr sig'imining 7- barobar oshishiga olib kelganligini ko'rsatdi.
Ular, shuningdek, xitozan odatda sentrifugalarda joylashadigan submikron zarralarini flokulyatsiya qilish orqali aniqlashtirish samaradorligini oshirishi haqida eslatib o'tadilar. Oldindan ishlov berish va flokulyatsiya usullari kelajakda vaktsinani filtrlash tushuntirishlarining bir qismi bo'lib qolishi mumkin. Penetrantlar, shu jumladan shakarlar, glikollar va aminokislotalar, afzallik bilan viruslarni flokulyatsiya qiladi. Osmotik eritma va 0.2µ mikrofiltratsiya bilan virus flokulyatsiyasi virusni tozalash uchun keng qamrovli jarayon sifatida ishlatilishi mumkin. Penetrantlar hidrofobik kapsullanmagan virus zarralarini va kapsulalangan virus zarralarini flokulyatsiya qilish uchun zarralar atrofidagi hidratsiya qatlamini kamaytirish orqali virus agregatsiyasini rag'batlantirishi mumkin. Penetrantlar viruslarni flokulyatsiya qilishlari ko'rsatilgan bo'lsa-da, bu usul kelajakda vaktsinani tozalash uchun platforma bo'lish potentsialiga ega va uning pilot yoki keng ko'lamli vaktsinani tozalashda maqsadga muvofiqligi isbotlanmagan. Kelajakda vaktsina filtrini tozalashning bir qismi bo'lishi mumkin bo'lgan flokulyatsiyani oldindan tozalash usuli 2 litrli fermentatorda amalga oshiriladi. Keng miqyosdagi ishlab chiqarish operatsiyalarida potentsial foydalanish uchun ushbu usullarni tajriba va ishlab chiqarish miqyoslarida tasdiqlash kerak.
2.2.1 Tizim ta'sirini ifodalash
Aniqlash usuli, asosan, yuqori oqim jarayonining turiga va ekspresyon tizimiga bog'liq bo'lib, u olib tashlanadigan ifloslantiruvchi moddalarning turi va darajasini belgilaydi. Virusli vaktsinalar odatda tovuq embrionlarida sut emizuvchilar yoki qushlarning uzluksiz hujayra chiziqlari yoki bakulovirus / hasharotlar hujayralari tomonidan ishlab chiqariladi, ular yanada murakkab ifoda tizimidir. VLP ning ayrim turlari boshqa geterologik ekspressiya tizimlari (bakteriyalar, xamirturushlar, o'simlik hujayralari) tomonidan ham ishlab chiqarilishi mumkin.
2.2.1.1 Tovuq embrionida ishlab chiqarilgan virus
Vaktsinalar tuxumda o'nlab yillar davomida ishlab chiqarilgan. Bu ish 1931 yilga to'g'ri keladi, Vudruff va yaxshi Yaylov unumdor tuxumlarning chorio-allantoik membranasini virus o'sishi uchun substrat sifatida muvaffaqiyatli qo'llagan. Bugungi kunda ushbu qadimiy jarayon yordamida ko'plab inson va veterinariya vaktsinalari ishlab chiqarilmoqda. Eng mashhuri, ehtimol, mavsumiy grippga qarshi emlashdir. Bu tamoyil tovuq tuxumlarini qiziqtiradigan viruslar bilan emlash va keyin chorio-allantoik membranada replikatsiya qilishdir. Ko'paytirishdan so'ng, virusli zarrachalarga boy allantoik suyuqlik to'planadi va tozalanadi.
Allantoik suyuqlik qiyin aniqlovchi ozuqa hisoblanadi. Uning yuqori mineral va oqsil miqdori (shu jumladan ovalbumin) unga yuqori yopishqoqlikni beradi. Allantoik suyuqlik shuningdek tovuq embrionlaridan patlar, tumshug'lar, qon tomirlari yoki qon hujayralari kabi muhim to'qimalar birikmalarini o'z ichiga oladi. Qattiq moddalar miqdori yuqori bo'lganligi sababli, past tezlikda santrifüjlash birlamchi tushuntirish uchun afzal qilingan variant bo'lib, odatda tiklanish tezligi taxminan 70% ni tashkil qiladi. Biroq, filtrlash usullaridan foydalangan holda birlamchi tushuntirishlar ham mumkin. NFF uchun polipropilen va tsellyuloza asosidagi chuqur filtrlar yaxshi allantoik suyuqlik to'plash qobiliyatiga ega. Polipropilen yoki tsellyuloza asosidagi chuqur filtrlardan tayyorlangan sirt filtrlari 150-210 L/m² sig‘imga ega bo‘lishi va ozuqa oqimining loyqaligini 3 barobarga kamaytirishi mumkin. Ochiq besleme kanali TFF qurilmasi allantoik suyuqlikni tozalash uchun ham mos keladi, chunki qurilma besleme kanali orqali minimal bosim yo'qotish uchun ko'proq mos keladi, shuning uchun kanal blokirovkasini kamaytiradi.
Ikkilamchi tushuntirish bosqichi NFF bilan osongina amalga oshirilishi mumkin. Polipropilen, tsellyuloza va shisha tolali materiallarning kombinatsiyasi odatda yaxshi samaradorlikni ko'rsatadi va ikkilamchi tozalash bosqichiga alternativa TFF va {0}}.65 mikron yoki 0,45 mikrofiltratsiya membranasi qurilmasidan foydalanish va osmotik oqimni ishlatishdir. nazorat qilish. Ushbu bosqichda hidrofilik PVDF yoki hidrofilik PES membranasi bo'lgan ochiq kanalli TFF qurilmasidan foydalanish mumkin.
Shuni ta'kidlash kerakki, virusli zarralar erimaydigan qoldiq moddasi bilan bog'liq bo'lishi mumkin, bu esa aniqlashtirish vaqtida virus ishlab chiqarishni sezilarli darajada kamaytirishi mumkin. Tuz eritmasidan foydalanish gripp viruslari va qattiq parchalar o'rtasidagi bu bog'lanishni kamaytirishi mumkin, natijada virus zarralarining yaxlitligiga ta'sir qilmasdan ishlab chiqarishni taxminan ikki baravar oshiradi.
2.2.1.2 Sutemizuvchilar va parrandalarning ketma-ket hujayra qatorlarida hosil bo'lgan viruslar
So'nggi paytlarda ba'zi virusli vaktsinalar tuxumga asoslangan jarayonlardan hujayra madaniyatiga asoslangan jarayonlar foydasiga (ayniqsa, grippga qarshi vaktsinalar uchun) uzoqlashdi. Ushbu o'tishning asosiy sababi embrion tuxumlari bilan bog'liq vaktsina ishlab chiqarish muammolarining oldini olishdir (ya'ni, har qanday parranda kasalligi avj olgan taqdirda yuzaga kelishi mumkin bo'lgan tuxum ta'minoti taqchilligi). Natijada, hozirgi vaqtda sut emizuvchilar yoki qushlarning uzluksiz hujayra liniyalari, an'anaviy hujayra liniyalari (masalan, Vero, MDCK yoki HEK293 hujayra liniyalari) yoki xususiy hujayra liniyalari yordamida ko'plab turdagi vaktsinalar va virus vektorlari ishlab chiqilmoqda.
Ekspressiya tizimiga qarab, virus hujayra ichida qolishi mumkin, bu hujayra lizis bosqichini talab qilishi yoki hujayradan tashqarida qolishi mumkin (lizis yoki tomurcuklanma). Hujayra madaniyatidan olingan qattiq yuk va eruvchan tarkib allantoik suyuqlik fazasidan ancha toza. Natijada, NFF texnologiyasini amalga oshirish osonroq va quvvati sezilarli darajada yuqori. Biroq, filtrlash qobiliyati hujayra zichligi yoki hosilni yig'ishda hujayraning hayotiyligi kabi hujayra madaniyati sharoitlariga juda bog'liq. Ushbu parametrlar chuqur filtrlar va membranalarni yopishi mumkin bo'lgan hujayra qoldiqlari va makroagregatlar miqdoriga ta'sir qiladi, natijada sig'im kamayadi.
Tomassen va boshqalar NFFni tushuntirishning yaxshi namunasini taqdim etadilar. Inaktivatsiyalangan poliovirus (IPV) ishlab chiqarish jarayonida qo'llaniladi. Mikrotashuvchilarda yetishtirilgan Vero hujayralari hujayra zichligi {0}},78 x 106 hujayra /ml TOI bo'lgan virusli proliferatsiya uchun ishlatilgan. Mikrotashuvchilarni hosildan olib tashlash uchun oldindan aniqlashtirish uchun 75 mkm zanglamaydigan po'latdan yasalgan ekran ishlatiladi. Ikki qavatli daraja zichlikdagi chuqur filtr (0.2-2.0 mkm) va undan keyin sterillangan nav filtri yordamida aniqlanadi.
Tanlangan miqyosli bir martalik birlik 350 L shkalada Sabin IPV klinik sinov materialini tayyorlash uchun muvaffaqiyatli ishlatilgan. Virusning serotipiga qarab, virusning tiklanish darajasi 86 dan 96 foizgacha olinadi.
2.2.1.3 Hasharotlar hujayralari tizimida hosil bo'lgan bakulovirus/virusga o'xshash zarralar
Keng miqyosda vaktsina ishlab chiqarish uchun bakulovirus/hasharotlar hujayralari tizimini ko'rib chiqish nisbatan yangi, ammo virusli vektorlar va VLP sohasiga qiziqish ortib bormoqda. Ushbu tizimning asosiy afzalligi shundaki, u qisqa muddatli (hujayra liniyalarini o'rnatishga hojat yo'q) va xavfsiz (to'liq virusli DNK yo'q) ishlab chiqarishni o'z ichiga oladi. Bundan tashqari, baculovirusni olib tashlash va mahsulot barqarorligi kabi ba'zi kamchiliklar mavjud.
GlaxoSmithKline tomonidan ishlab chiqarilgan inson papillomavirusi infektsiyasiga qarshi VLP vaktsinasi Cervarix, hasharotlar hujayralarida tijorat maqsadida ishlab chiqarilgan birinchi inson vaktsinasidir. Hozirgi vaqtda bakulovirus bilan kasallangan hasharotlar hujayralarida ishlab chiqarilgan VLP va rAAV vektorlariga asoslangan bir qator vaktsinalar ishlab chiqilmoqda. Kuzgi armiya qurti Spodoptera frugiperda (Sf9 va Sf21) va karam egilish qurti Trichoplusia ni (BTI-TN5B1-4 hujayralar) dan olingan hasharotlar hujayralarining liniyalari suspenziyada o'sish qobiliyati tufayli eng ko'p qo'llaniladi, bu esa oqimning ko'payishini osonlashtiradi. jarayon. Tirik hujayralarning kerakli zichligiga o'sgandan so'ng, bu hujayralar oqsillarni ifodalash uchun eksponent hujayra o'sish bosqichida rekombinant bakulovirus bilan kasallanadi. Baculoviruslarning katta genomi VLP va virus vektorlarining murakkabligiga mos keladigan besh yoki undan ortiq turli xil oqsillarni ifodalashga imkon beradi.
Bernard va boshqalar. hasharotlar hujayra madaniyatining quyi oqimi jarayonini tasvirlab berdi. Jarayon juda o'zgaruvchan bo'lib, ushbu texnikada ishlab chiqarilgan oqsillarning xilma-xilligini aks ettiradi. Tozalash ketma-ketligining birinchi bosqichiga bioreaktorning hajm xususiyatlari (ya'ni, hujayra zichligi va hayotiyligi) yoki mahsulotning chiqarilish tabiati (kurtaklanishi yoki hujayra lizisi orqali chiqariladi) katta ta'sir ko'rsatadi. Hasharot hujayralarining bakulovirus infektsiyasi 3-5 kun ichida hujayra parchalanishiga olib kelishi mumkin. Hujayralarning yo'q qilinishi proteolitik faollikning oshishiga va rekombinant oqsillarning parchalanishiga olib keladigan boshqa atrof-muhit omillariga olib kelishi mumkin.
Hujayra lizisini boshlash qobiliyati pastroq bo'lgan bakuloviruslarni ishlab chiqishga urinishlar bo'lgan. Baculovirus yuqtirgan hasharotlarning 10 foizdan kamini lizis qiladi.
Hujayra lizisini muzlatish-eritish, yuvish vositalari, homogenizatorlar yoki ultratovush bilan davolash kabi turli usullar yordamida amalga oshirish mumkin. Hasharot hujayralari hujayra devoriga ega emas va shuning uchun tezda eriydi. Ko'pgina dastgoh jarayonlarida ultratovushli davolash haqida xabar berilgan bo'lsa-da, u eksperimental yoki tijorat miqyosida kamdan-kam qo'llaniladi. Eng keng tarqalgan usul - past konsentratsiyali detarjan (0,1% Triton X-100 yoki NP-40) ishtirokida hujayralarni yo'q qilish uchun gomogenizatordan foydalanish. Yuvish vositalaridan foydalanish va mikrofluidizatsiya yoki osmotik ta'sir gomogenizatsiyasi ko'plab yirik ishlab chiqarish jarayonlarida muvaffaqiyatli qo'llanilgan. Odatda, hasharotlar hujayralari lizis buferlarida (50 mM TRIS pH7,7, 3{15}}0 mM NaCl, 5% glitserin, 0,2 mM PMSF va proteaz inhibitörlerinde) suspenziya qilinadi, bunda Triton-X100 0,1% yakuniy konsentratsiyaga qo'shiladi, so'ngra engil ultratovush yoki mikrofluidizatsiya. Keyin aralash erimaydigan zarralarni olib tashlash uchun santrifüj qilinadi.
Ushbu bosqichda lizat juda bulutli ko'rinishi mumkin va uni 0.45 mkm filtr yordamida filtrlash qiyin. Ba'zida pirolizni aniqlashtirish bosqichida 30% gacha yo'qotishlar kuzatilishi mumkin. Bo'linish bosqichida benzofermentlarning qo'shilishi filtrlash muammosini hal qilishga yordam beradi. Hujayralarni o'rim-yig'imdan keyin fosfat buferli sho'r suv bilan tozalash va kreking tamponini o'z ichiga olgan yuqori tuzda (500 mM NaCl) tez "muzlatish-eritish" agregatlarni olib tashlashga yordam beradi.
VLP va hasharotlar hujayralari tomonidan ishlab chiqarilgan virusli vektorlarning aniqlanishi hujayra lizisidan keyin (kimyoviy yoki mexanik davolash orqali) sodir bo'ladi, bu nafaqat virus zarralarini, balki ko'p miqdorda hujayrali nuklein kislotani ham chiqaradi. Hasharot hujayralari 1-9.10 6 hujayra/ml dan yuqori hujayra zichligida oʻsishi mumkin. Shuning uchun, aniqlashtirish bosqichi yuqori hujayra zichligi, yuqori nuklein kislota tarkibi va iloji bo'lsa, bakulovirus zarralarini olib tashlash bilan shug'ullanishi kerak. Vaziyatni yanada murakkablashtirish uchun VLP yoki virus vektorlari va bakuloviruslarning o'lchamlari bir xil bo'lishi mumkin (baculoviruslar kengligi 60-80 nanometr va uzunligi 300-400 nanometr). Hujayra zichligi yuqori bo'lganligi sababli, santrifüjlash o'nlab yillar davomida birlamchi tushuntirish uchun afzal qilingan usul bo'lib kelgan. Biroq, membranaviy jarayonlar juda jozibali alternativ bo'lib ko'rinadi, chunki miqyosni aniqlash oson.
Chuqur filtrlar uch qatlamli rotavirusga o'xshash zarrachalarning quyi oqimida samarali qo'llanilgan. Laboratoriya darajasida CsCl zichligi gradienti ultratsentrifugalash usuli ko'pincha ushbu murakkab zarralarni tozalash uchun ishlatiladi. Tadqiqotchilar nafaqat chuqur filtrni aniqlashtirish bosqichini, balki butun quyi oqim jarayonini ham baholadilar (Triton X-100 parchalanishi va chuqur filtrlash, keyin ultrafiltratsiya va zarracha hajmini istisno qilish). Natijalar shuni ko'rsatadiki, CsCl zichligi gradientining rentabelligi 37% ga yetishi mumkin.
Ultra santrifugal usul taxminan 10% ni tashkil qiladi. Yana bir misol sifatida, 0,45 mikron ichi bo'sh tolalar va 500 kDa nozik diametrli tolalar hasharotlar hujayralarida hosil bo'lgan OIVga o'xshash zarralarni tiklash va konsentratsiyalash uchun ishlatilgan. Ushbu tadqiqotda ichi bo'sh tolalarning kesish kuchi hujayra yaxlitligi asosida optimallashtirildi. Natijalar Stol shakar gradienti ultratsentrifugasini almashtirish uchun past kesish kuchi jarayoni o'rnatildi.
Jarayon ommaviy ishlab chiqarishda qo'llanilishi mumkin. Chuqur filtrlar rekombinant adeno bilan bog'langan viruslarni ishlab chiqarishda ham muvaffaqiyatli qo'llanilgan. Hujayra lizisi ikki porshenli mexanik hujayra murabbo bilan amalga oshirildi, so'ngra nukleaz bilan ishlov berildi. Aniqlash bosqichida 1,2 mkm shisha tolali chuqur filtr elementi, undan keyin ikki qatlamli 0.8 mkm hidrofilik PES va 0 .2 mkm gidrofil PES ishlatilgan. Proportsional oʻlchamdagi filtrlar kichikroqdan 200 L oʻlchamgacha boʻlgan texnologik partiyalar uchun ishlatiladi. Chuqur filtrlar muvaffaqiyatli qo'llanildi va 0,2 mkm yoki 0,45 mikron tekis plyonkalar yoki ichi bo'sh tolalar bilan TFF reytinglari ham juda samarali ekanligi xabar qilindi.
Portugaliyadagi Oeiras Eksperimental Biologiya Institutida Tecnologica (IBET) tomonidan olib borilgan tadqiqotda NFF dan santrifüjsiz bakuloviruslar tomonidan ifodalangan gepatit C VLPni aniqlashtirish uchun foydalanilgan. Nominal nominal polipropilen filtrlar (10,5,0.6 va 0.3mkm) filtrlar VLP hosilini aniqlashtirish uchun ishlatiladi. 0,6 mkm va 0,3 mkm g'ovak ko'rsatkichlariga ega bir xil filtrlar VLP yig'ish markazlarida filtrlash uchun ishlatiladi. O'rganilgan barcha filtratlar HCV-VLP tiklanish tezligi uchun sinovdan o'tkazildi va tavsiya etilgan filtrlash usullari solishtirildi. Natijalar 4-jadvalda keltirilgan.
Natijalar shuni ko'rsatdiki, to'g'ridan-to'g'ri yig'ib olingan gepatit C VLP ozuqasi uchun 5 m-0, 3 mkm filtr eng yuqori mahsulot tiklanishiga ega (1{4}}0%). 0,6 mkm polipropilen filtri markaziy ozuqa uchun eng yuqori mahsulotni qayta tiklashga ega (82%) va mezbon hujayraning DNK klirensi taxminan 70% ni tashkil etdi.
2.2.1.4 Bakterial yoki xamirturush tizimlarida hosil bo'lgan virusga o'xshash zarralar
Bakterial yoki xamirturush tizimlarida ifodalangan VLP vaktsinalari uchun tushuntirish usuli turi VLP ning hujayradan tashqari vositachilarga chiqarilishiga bog'liq. Agar VLP ni samarali tarzda ajratib bo'lmasa, aniqlashtirish bosqichidan oldin hujayra lizisi yoki boshqa ekstraksiya bosqichlari talab qilinishi mumkin. Bu oqsillarni tozalash sanoatida oltin standart bo'lsa-da, bakterial yoki xamirturushga asoslangan tizimlarda ifodalangan santrifüjlash (doimiy yoki partiyaviy) bo'lsa-da, yaqinda membrana jarayonlari o'lchov qulayligi va bir martalik foydalanish bilan mosligi tufayli juda jozibali alternativaga aylandi. muolajalar.
Rixter va Topell aniqlangan E. coli da ishlab chiqarilgan VLPlarni tayyorlashda santrifüjlash, TFF yoki ikkalasining kombinatsiyasidan foydalanishni tushuntiradi. Ularning ishlarida 5 daraja haroratda gomogenlangan E. coli gomogenatlarini suyultirish va tiniqlashtirish uchun 0.45m TFF membranalari ishlatilgan. Shuningdek, ular membrana asosidagi TFF yuqori viskoziteli yig'im-terimlarni qayta ishlash uchun mos ekanligini ta'kidlaydilar, yaxshisi ochiq kanal konfiguratsiyasiga ega TFF birliklaridan foydalangan holda.
TFFga muqobil sifatida markazdan qochma aniqlik ham baholandi. Bunday holda, hosil bo'lgan gomogenat suyultirilmadi va 105 daqiqa, 10000g davomida 4 daraja santrifüj qilindi. Yumshoq qoplamani o'tkazmasdan, supernatant zarrachalardan to'kilgan va 60 daqiqa davomida 4 daraja va 10000 g da qayta santrifüj qilingan. Keyin supernatant mavjud zarrachalardan olib tashlandi, EB buferi (43,89 mM Tris HCl, 6,11 mM Tris Base, 5,0 mM EDTA, 10% (v/v) Triton X-100) 1:2 nisbatda suyultirildi va filtrlanadi. 0,22 m steril filtr qurilmasida. Keyinchalik qayta ishlash. Xabar qilinishicha, 800L miqyosda E. coli da ushbu VLP vaktsinasini ishlab chiqarish ko'lamini kengaytirish jarayoni, shuningdek, sentrifugalash va TFF kombinatsiyasi orqali aniqlangan.
Rekombinant gepatit E vaktsinasi HEV 239 Xitoyda 16 yosh va undan katta yoshdagi kattalarni emlash uchun litsenziyalangan. Vaktsina antijenleri (VLP) E. coli da ifodalanadi va antigen ishlab chiqarish jarayonining miqyosi 50L shkalada ekanligi ko'rsatilgan. Mahsulot E. coli ning yorilishi yo'li bilan ekstraktsiya qilindi va inklyuziya tanalari 2% Triton X-100 o'z ichiga olgan bufer bilan qattiq yuvish orqali hujayra bo'laklaridan ajratildi va keyin 4 M karbamid gomogenizator bilan eritildi. TFF Saccharomyces cerevisiae (15L) da ishlab chiqarilgan inson papillomavirusi VLPga aniqlik kiritadi. Nukleaza bilan ishlangan hujayra lizatasi 0,65 mikron ichi bo'sh tolali filtr yordamida transfiltratsiya rejimida o'zaro oqim mikrofiltratsiyasi bilan aniqlandi. Xuddi shu jarayon vaktsina ishlab chiqarishda qo'llaniladi. VLP asosidagi vaktsinalarning bir nechtasi tijorat miqyosiga yetgan bo'lsa-da, bir nechta VLP asosidagi vaktsinalar ishlab chiqilmoqda, ularning aksariyati santrifugalash yoki membrana texnologiyasidan foydalangan holda aniqlangan.
Kosmosning ta'siri bilan cheklangan, biz keyingi bobda kontentning ikkinchi yarmini baham ko'ramiz. Keyingi maqolada biz vaktsinani tushuntirish va tegishli membrana komponentlarini qo'llashning ba'zi holatlarini baham ko'ramiz.
Mahalliylashtirish sxemasidagi birinchi kompaniya sifatida Guidling Technology vaktsinani tushuntirish bo'yicha etarli tajriba to'pladi. Guidling Technology - biofarmatsevtika va hujayra madaniyati, tozalash va ajratishga qaratilgan ishlab chiqish va ishlab chiqarish kompaniyasi. Mahsulotlar biomeditsina, diagnostika, sanoat suyuqlik filtratsiyasi, aniqlash, tozalash, tozalash va kontsentratsiya jarayonida keng qo'llaniladi; Guidling biofarmatsevtika va hujayra madaniyatini qo'llash stsenariylariga to'liq javob beradigan ultrafiltratsiya santrifüj trubkasi, ultrafiltratsiya / mikrofiltratsiya membranasi kassetasi, virusni yo'q qilish filtri, tangensial oqim filtri qurilmasi, chuqur membrana stack va boshqalarni muvaffaqiyatli ishlab chiqdi.
Bizning membranalarimiz va membrana filtrlarimiz konsentratsiya, ekstraktsiya va oldindan filtrlash, mikrofiltratsiya, ultrafiltratsiya va nanofiltratsiyani ajratishda keng qo'llaniladi. Kichik bir martalik laboratoriya filtrlashdan tortib ishlab chiqarish tipidagi filtrlash tizimlariga, sterillik sinovi, fermentatsiya, hujayra madaniyati va boshqalarga qadar keng mahsulot qatorimiz sinov va ishlab chiqarish ehtiyojlarini qondira oladi.
