Ultrafiltratsiya naychasidan foydalanish bo'yicha ehtiyot choralari
(1) Tegishli ultrafiltratsiya trubkasini tanlang. Odatda, saqlanishi kerak bo'lgan molekulyar og'irlik maqsadli oqsilning molekulyar og'irligining 1/3 qismidan oshmasligi kerak. Misol uchun, agar maqsadli oqsilning molekulyar og'irligi 35 kDa bo'lsa, molekulyar og'irligi 10 kDa bo'lgan ultrafiltratsiya naychasini tanlash mumkin. Agar maqsadli oqsilning molekulyar og'irligi taxminan 10kd bo'lsa, molekulyar og'irligi 3KD bo'lgan ultrafiltratsiya naychasidan foydalanish mumkin. Foydalanish bo'yicha qo'llanmani diqqat bilan o'qing va ultrafiltratsiya membranasining turli xil kimyoviy moddalarga nisbatan turli bardoshliligiga e'tibor bering.
(2) Yangi sotib olingan ultrafiltratsiya quruq. Ishlatishdan oldin o'ta toza suv qo'shing va suv butunlay membranadan o'tadi. Muzli hammomda yoki muzlatgichda bir necha daqiqa oldindan sovutib oling. Keyin suvni to'kib tashlang va oqsil eritmasini qo'shing. Qo'shilgan miqdor naychaning yuqori qismidagi oq chiziqdan oshmasligi kerak. Operatsiya engil bo'lishi kerak. Protein eritmasini qo'shishdan oldin ultrafiltratsiya trubkasini oldindan sovutish uchun muz ustiga qo'yish kerak.
(3) Balans. Ham massa, ham og'irlik markazi muvozanatli bo'lishi kerak. E'tibor bering, tezlik va tezlashuv juda tez bo'lmasligi kerak, aks holda ultrafiltratsiya membranasi bevosita shikastlanadi. Santrifüj ultrafiltratsiyani boshlang (tsentrifugani 4 darajagacha oldindan sovutish). Turli santrifugalarning aylanish tezligi G ga aylantirilgandan so'ng, u boshqacha. Membranaga bosimni pasaytirish uchun santrifüjning tezlashishini eng past vitesga sozlang. Esda tutingki, santrifugani tark etishdan oldin siz santrifüj maqsadli tezlikka yetguncha kutishingiz kerak, aks holda santrifugada muammo yuzaga kelganda, siz birinchi marta u bilan shug'ullana olmaysiz. Membrananing va aylanadigan milning yo'nalishi ko'rsatmalarga muvofiq sozlanishi kerak (burchakni aylantiruvchi santrifugada membrana milga perpendikulyar). Amaliy foydalanishda tezlik odatda qo'llanmadagidan past bo'lib, markazdan qochma trubaning xizmat muddatini uzaytirishi mumkin.
(4) Qolgan 1 ml ga konsentrlanganda, ultrafiltratsiya trubkasidan oqsil oqishi yoki yo'qligini aniqlash uchun 50ul bufer eritmasini oling va uning ko'k rangga aylanganligini tekshirish uchun 10ul qo'shing. Agar trubka oqsa, yuqori qatlamni to'kib tashlang va yangi trubkadan oqib o'ting va ultrafiltratsiyani boshlang. Naycha oqayotganligini aniq aniqlash uchun 5 mgml BSA bilan 10 daqiqa davomida santrifüj qiling, so'ngra oqimdan o'tkazing, qo'pol o'lchash uchun oqsil elimini yoki Bredforddan o'tkazing va konsentratsiya uchun qolgan protein eritmasini qo'shishda davom eting (oqsil bo'lmasligi uchun muz ustida ishlang. isitiladi) barcha konsentrlangan eritmalar qo'shilmaguncha. Santrifüj paytida oqsil yog'inlari paydo bo'ladimi yoki yo'qligiga e'tibor bering, natijada quvur tiqilib qoladi. Agar yog'ingarchilik yuzaga kelsa, yog'ingarchilikning o'ziga xos sababini aniqlang, oqsil kontsentratsiyasi juda yuqori yoki bufer mos emas; Birinchisi, konsentratsiyani kamaytirish uchun bir nechta ultrafiltratsiya naychalari bilan bir vaqtning o'zida ultrafiltratsiya orqali hal qilinishi mumkin. Ikkinchisi, oqsil cho'kmaguncha turli xil bufer eritmalarini o'zgartirishdir.
(5) Oldingi bosqichlar oqsilni konsentratsiyalash uchun ishlatiladi. Agar siz buferni o'zgartirmoqchi bo'lsangiz, umumiy protein eritmasi taxminan 1 ml ga konsentrlanganda, muloyimlik bilan yangi bufer qo'shing (0.22um ultrafiltratsiya membranasi orqali ultrafiltratsiya), so'ngra ketma-ket uch marta taxminan 1 ml ga konsentratsiya qiling. Oxirgi kontsentratsiyaning yakuniy hajmi talab qilinadigan protein kontsentratsiyasiga bog'liq bo'lib, u odatda 500ul dan oshmaydi yoki uni 200ul dan kamroq joyga jamlash mumkin. Har safar kamida 10 marta hajmli konsentratsiyaga ko'ra, u 1000 martadan ko'proq uch martaga yetishi mumkin, bu asosan tamponni o'zgartirish maqsadiga erishishi mumkin.
