Qon mahsulotlarini inaktivatsiya qilish va viruslarni olib tashlash texnologiyasi

Qon mahsulotlari - bu "plazma oqsili komponentlari yoki qon hujayralari komponentlari, masalan, inson qon albumini, inson immunoglobulini, inson koagulyatsion omili (tabiiy yoki rekombinant) qizil qon hujayralari kontsentrati va boshqalar, sog'lom inson plazmasidan yoki maxsus immunitetli inson plazmasidan ajratilgan, tozalangan yoki diagnostika, terapiya yoki passiv immunoprofilaktika uchun rekombinant DNK texnologiyasi bilan yaratilgan. Qon mahsulotlari shoshilinch tibbiy yordam, urush jarohatlarini qutqarish va ayrim o'ziga xos kasalliklarning oldini olish va davolashda muhim rol o'ynaydi.

 

Normativ fon

Xavfsizlikni ta'minlash amaliyoti yakuniy dori regulyatorlar va, pirovardida, bemorlar va jamoatchilik uchun xavfsiz bo'lishini ta'minlashi kerak. 1990-yillarda Xalqaro muvofiqlashtirish konferentsiyasi (ICH 1998) "Q5A: Inson yoki hayvonlarning kelib chiqishi hujayralarining biotexnologik mahsulotlarining virusli xavfsizligini baholash" (Q5A: Virus xavfsizligini baholash) ni chiqardi va virus xavfsizligi uchun butun dunyo standartini yaratdi.

ICH Q5A ushbu maqsadga erishish uchun tekshirish va tozalash uchun ko'p bosqichli sxemani tavsiflaydi. Sinov dasturi mahsulot xavfini tahlil qilish bilan to'ldirilgan hujayra banki, xom ashyo va bioreaktor yig'ishga qaratilgan. Sinovga qo'shimcha ravishda, ICH Q5A quyi oqimdagi zararsizlantirishni yuqori oqimda ifloslantiruvchi moddalar aniqlanmasa, xavfsiz chora sifatida baholashni talab qiladi. Tozalashni tekshirish, agar biron bir virus sinov rejimidan qochsa, uni yakuniy dori mahsulotiga tushishidan oldin olib tashlash va/yoki inaktivatsiya qilish mumkinligini taʼminlaydi.

 

Umumiy virus xavfsizligi dasturi haqida ma'lumot

Zamonaviy biotexnologiya ishlab chiqarishda (yoki bioprocessing) odatda virusni yo'q qilish yoki faolsizlantirishga qodir bo'lgan butun tozalangan ketma-ketlikda uch yoki to'rt birlik operatsiyalar mavjud. Bunga ma'lum xromatografik bosqichlar (masalan, A proteini yoki anion almashinuvi), past pH yoki yuvish vositalarining madaniyati va virusni ushlab turish filtrlari kiradi. Ushbu qadamlarning hammasi ham barcha viruslarni samarali ravishda olib tashlamaydi yoki faolsizlantirmaydi.

Masalan, past pH madaniyati odatda konvertsiz virus inaktivatsiyasi uchun samarasiz, lekin u konvertli virus inaktivatsiyasi uchun yaxshi ishlaydi. Muayyan ish sharoitida anion almashinuv ustuni neytral izoelektrik viruslarni mahsulot oqimidan bog'lay olmaydi va olib tashlamaydi, ammo u kislotali viruslarga qarshi samarali bo'ladi.

Bu biotexnologiya mahsulotlarining virus xavfsizligini ta'minlaydigan uch-to'rtta mustaqil va ortogonal birlik operatsiyalarining kombinatsiyasi.

 

Umuman olganda, mustahkam, samarali va ishonchli ishlov berish bosqichi ko'p sonli viruslarni (odatda 4 log10 yoki undan ko'p deb ta'riflanadi) olib tashlash yoki faolsizlantirishga qodir bo'ladi, deb taxmin qilinadi (bu erda logni qisqartirish qiymati yoki LRV jami log10 sifatida hisoblanadi). kirishdagi viruslar soni chiqishdagi viruslarning umumiy soniga bo'linadi). Biroq, LRV qadam samaradorligining yagona mutlaq o'lchovi sifatida ishlatilishi mumkin emas. Ma'lumotlar dastlabki bo'lishi mumkin. Modellashtirish oson, jarayon sharoitlarining o'zgarishiga nisbatan sezgir emas va bir qator viruslarga qarshi samarali (JSST 2004).

Virusli filtratsiya bunday kuchli va samarali jarayon sifatida keng e'tirof etilgan va biotexnologiya mahsulotlarini ishlab chiqarish jarayonida ekzogen va endogen virusli zarrachalar xavfini minimallashtirish bo'yicha umumiy strategiyaning asosiy tarkibiy qismidir.

Virusli filtrlar ko'pincha kuchli, o'lchamga asoslangan saqlash mexanizmlari orqali ishlaydi. Ushbu kuchli ta'sir mexanizmiga asoslanib, virusli filtrlar xromatografik qadamlarga qaraganda bir qator viruslar uchun oldindan taxmin qilinadigan virusni ushlab turishni ta'minlaydi. Buning sababi shundaki, filtr turli viruslarning fizik-kimyoviy xususiyatlaridagi farqlar va ish sharoitlari bilan tartibga solinadigan virus-qatronlar o'zaro ta'siridan kamroq ta'sir qiladi. Shuning uchun, virusli filtrlash bosqichi odatda yaxshi ishlab chiqilgan rekombinant terapevtik oqsillarni tozalash jarayonlarida (EMEA 1996) qo'llaniladi, bu ham plazmani qayta ishlash sanoatida mustahkam ishlashga ega ekanligi ko'rsatilgan.

 

Biroq, qon mahsulotlari ikki qirrali qilichga o'xshaydi, bu nafaqat minglab odamlarning hayotini saqlab qoladi, balki kasalliklarni tarqatish va inson salomatligiga xavf tug'dirish imkoniyatiga ega. Statistik ma'lumotlarga ko'ra, 1977 yildan 1984 yilgacha Qo'shma Shtatlarda kamida 30 000 qon oluvchi OITS virusi bilan kasallangan qon olgan. 1985 yilda Frantsiyadagi 3{9}} gemofiliya kasalligidan 1200 nafari qon quyish yoki qon preparatlari orqali OITS bilan kasallangan.

Jahon sog'liqni saqlash tashkiloti ma'lumotlariga ko'ra, butun dunyo bo'ylab OITS infektsiyasining 5% dan 10% gacha OITS bilan kasallangan qon yoki qon mahsulotlarini quyish natijasida yuzaga keladi. Xitoyda OITSning birinchi holati OITS virusi bilan kasallangan import qilingan qon mahsulotlaridan foydalangan holda yuqtirilgan. Bundan tashqari, qon va qon mahsulotlarini quyish natijasida gepatit B va C kasalliklarining yuqishi ham qayd etilgan.

 

1. Qon mahsulotlari orqali yuqadigan asosiy viruslar va ularning xususiyatlari

1-jadvalda ko'rsatilganidek, qon va qon mahsulotlari orqali yuqadigan viruslarning ko'plab turlari mavjud. Ular orasida OIV, HBV va HCV yuqori infektsiya darajasi va jiddiy zarari tufayli mahalliy va xorijiy tibbiyot doiralarini tashvishga solmoqda.

Qon va qon mahsulotlari viruslarni tarqatish imkoniyatiga ega bo'lganligi sababli, uning kasalliklarning oldini olish va davolashda qo'llanilishiga jiddiy ta'sir ko'rsatdi. Shuning uchun qon mahsulotlarini ishlab chiqarishda qon mahsulotlarining xavfsizligini ta'minlash uchun virusni inaktivatsiya qilish va olib tashlash jarayonlarini qo'shish kerak.

2. Virusni inaktivatsiya qilish va olib tashlashning asosiy usullari

Qon mahsulotlarining xavfsizligini ta'minlash uchun qon donorlarini tanlash, iloji bo'lsa immunizatsiya, to'plangan qonni qat'iy tekshirish va boshqa chora-tadbirlar bilan bir qatorda, qon mahsulotlarini virus bilan davolashni inaktivatsiya qilish va olib tashlash muhim bo'g'indir. qon quyish xavfsizligi. Viruslarni inaktivatsiya qilish va yo'q qilishning bir necha keng tarqalgan va samarali usullari quyida batafsil tavsiflangan.

 

I. Viruslarni inaktivatsiya qilish usullari

1. Paster usuli

Bu usulning nazariy asosi shundan iboratki, harorat va harakat vaqtini tanlash orqali virus strukturasini yo'q qilish tezligi oqsil tuzilishiga qaraganda ancha yuqori. Taxminan 50 yillik klinik foydalanish natijalari va yaqinda hayvonlarda olib borilgan tajribalar shuni tasdiqladiki, albumin 60 daraja, 10 soat qizdirilgandan so'ng, ya'ni Paster dezinfeksiyasidan so'ng, nafaqat HBV ni faolsizlantirish, balki HCV va OIVni ham inaktivatsiya qilish, albuminni eng ishonchli vositaga aylantirishi mumkin. virus xavfsizligida qon mahsuloti.

So'nggi paytlarda Paster jarayoni IVIG, FVI, FIX, fibrinogen va boshqa mahsulotlarni ishlab chiqarishga kengaytirildi. Bridonnccu va boshqalar. ushbu virusni inaktivatsiya jarayonini past haroratli etanol ishlab chiqarish IVIG jarayoniga qo'shdi, ya'ni Paster usuli stabilizatorsiz, past tuz va kislotalilik sharoitida amalga oshirildi va virus titri 5 Log ga kamaydi. Simmonds va boshqalar. Buyuk Britaniyada klinik jihatdan qo‘llaniladigan FVⅢ va FIX konsentrlangan preparatlarning transfuzion orqali o‘tuvchi virusini (TTV) sinovdan o‘tkazdi va Paster virusi inaktivatsiyasi bo‘lmagan mahsulotlarning TTVni aniqlash darajasi 50% dan 75% gacha va ijobiy aniqlash darajasi aniqlandi. Paster inaktivatsiyasidan keyin mahsulotlar soni 0 ga teng edi.

Birlashgan Qirollikdagi faol bo'lmagan qon ivish omili mahsulotlarini qo'llagan 84 gemofiliya bilan og'rigan bemorlarda TTV ijobiy darajasi 27% ni tashkil etgan bo'lsa, virus bilan faollashtirilmagan qon ivish omili mahsulotlarini qo'llagan 19 bemordan faqat 1 tasi ijobiy bo'lib, ijobiy aniqlash darajasi 5% ni tashkil etdi. Shuning uchun virusni inaktivatsiya qilish jarayoni qon mahsulotlarining xavfsizligini oshirishda juda samarali.

 

2. Sirt faol moddalar bilan birlashtirilgan organik erituvchi (S/D usuli)

This method was first established by Horowitz et al., a blood center in New York, the principle is that organic solvents can make lipids fall off the surface of the virus, so that the structure of the virus is destroyed and the infection activity is lost. The common S/D method uses n-butyl triphosphate (TNBP) in combination with different surfactants such as Tine80, Triton X100, and sodium cholate. The effect of S/D method on the inactivation of lipid-coated viruses in blood products has been confirmed. For example, when FI concentrated preparations were treated with 0.3%TNBP and 0.2% sodium cholate at 24℃ for 6 h, the inactivation of HBV and HCV was >4 Log,HIV >4.5 Log, and the inactivation of VSV and Sindbis viruses was >4.5 Log, and the recovery rate of FVIII was >90%. S/D usuli bilan faollashtirilgan ko'p miqdordagi qon mahsulotlari uzoq muddatli klinik qo'llash orqali xavfsiz va ishonchli ekanligi isbotlangan, shuning uchun ular keng qo'llaniladi. Biroq, bu usul parvovirus B19, HEV va boshqa lipo-qoplanmagan viruslarga qarshi inaktivatsiya qobiliyatiga ega emas.

 

3. Quruq issiqlik inaktivatsiyasi usuli

Quruq issiqlik inaktivatsiyasi liyofilizatsiyalangan preparatni isitish orqali davolashni va virusni quruq issiqlik bilan o'ldirishni anglatadi. Odatda ishlatiladigan quruq issiqlik usullari 60 daraja ~80 daraja, 10~72 soat isitish usuli va 80 daraja, 72 soat davolash usulidir. 1980-yillarning boshlaridayoq FVIII liyofillangan konsentrlangan preparat va protrombin kompleksini 60-80 daraja haroratda 10-72 soat davomida isitish foydali bo'lgan. Biroq, bu usul HBV, HCV, OIVni butunlay inaktivatsiya qila olmasligi isbotlangan. 80 daraja va 72 soat haroratda quruq issiqlik bilan ishlov berish HBV, HCV va OIVni inaktivatsiya qilishda samarali ekanligi isbotlangan. Bundan tashqari, yaqinda 100 daraja ishlov berilgan koagulyatsiya omillarining liyofilize qilingan preparatlari haqida xabarlar bor. Xu Jinbo va boshqalar IgG ni 100 daraja 30 daqiqa davomida davolashdi va inaktivatsiyalangan vesikulyar stomatit virusi 8.2 Log. Ba'zi odamlar quritilgan FVIII ni 68 daraja haroratda 72 soat, quruq holatda muzlatib qo'yishadi va keyin 0,5 ~ 1 soat davomida 100 daraja isitiladi. Bu usul nisbatan tejamkor.

 

4. Fotokimyoviy usul

This method was first proposed by Matthews et al. The principle is that some photosensitizers have a strong affinity for the surface of the virus and the structure of the viral nucleic acid, and are easily activated under appropriate wavelength of light, thus destroying the structure of the virus in contact with them through photochemical action. The photosensitizers that have been used include: hemacoline derivatives, psoralide derivatives, phenothiazines, phthalocyanines, and cyanine 540, etc. The main feature of this method is that it can be used to inactivate the virus of whole plasma, and the inactivation of the virus of platelet products is the current research focus. Scientists from the Department of Experimental Medicine at the University of California in the United States have screened out a new psoralen derivative S-59 among more than 100 chemical modifications of psoralen. The platelets were irradiated with 150 um S-59 combined with 3 J/cm2 UVA, which could inactivate >6.7 Log of free HIV and >6.6 OIV bilan bog'langan hujayralar jurnali va trombotsitlar in vitro 7 kunlik funktsional saqlanishdan so'ng yaxshi bo'lib qoldi, bu FDA tomonidan klinik sinovlar uchun tasdiqlangan.

Ushbu usullar orasida Paster dezinfeksiya usuli va S/D usuli Qo'shma Shtatlar FDA tomonidan tasdiqlangan va dunyoda keng qo'llaniladi. Quruq issiqlik inaktivatsiyasi usuli asosan liyofillangan preparatlarni virusni inaktivatsiya qilish uchun javob beradi. Fotokimyoviy usul lipid bilan qoplangan viruslarga kuchli inaktivatsiya ta'siriga ega va Evropada butun plazma virusini inaktivatsiya qilishda qo'llanilgan va qon hujayralari tarkibiy qismlarida virusni inaktivatsiya qilish uchun keng istiqbolga ega. Biroq, bu usullarning barchasi o'z kamchiliklariga ega, masalan, Paster sterilizatsiyasi ba'zi issiqlikka chidamli viruslarni inaktivatsiya qilish uchun ideal emas; S/D usuli lipo-qoplanmagan virusni samarali tarzda inaktivatsiya qila olmadi. Fotokimyoviy usul ba'zi plazma oqsillarining faolligini sezilarli darajada buzdi. Kuzatuv tekshiruvlarining hozirgi klinik qo'llanilishi shuni ko'rsatadiki, hech qanday virusni inaktivatsiya qilish usuli qon mahsulotlari viruslarni yuqtirish xavfidan mutlaqo xoli ekanligini kafolatlay olmaydi.

 

I. Viruslarni yo'q qilish jarayoni

Qon mahsulotlarini ishlab chiqarishda bitta inaktivatsiya jarayoni barcha viruslarni inaktivatsiya qila olmaydi; Bundan tashqari, virusning o'zi heterologik oqsil bo'lib, mahsulot bilan kirish salbiy reaktsiyalarni keltirib chiqaradi; Shu bilan birga, texnik darajaning cheklanganligi sababli, xarakteristikalari topilmagan yoki tushunilmagan viruslar mavjud, shuning uchun mavjud virusni inaktivatsiya qilish usullari ushbu viruslarning inaktivatsiya ta'sirini kafolatlay olmaydi. Shuning uchun inaktivatsiyaning o'zi mahsulot xavfsizligini kafolatlay olmaydi va uni mahsulotdan olib tashlash kerak. Shunday qilib, viruslarni yo'q qilish texnologiyasiga tobora ko'proq e'tibor qaratilmoqda. Ikkita tez-tez ishlatiladigan va samarali viruslarni olib tashlash jarayoni quyida qisqacha tavsiflanadi.

1. Xromatografik texnologiya

Xromatografik texnologiya turli komponentlarni ajratishga erishish uchun turli komponentlar va statsionar faza yaqinligi yoki o'zaro ta'sir farqlaridan foydalanishni anglatadi. Qon mahsulotlarini ishlab chiqarishning ilg'or texnologiyasi sifatida xromatografiyaning o'zi viruslarni, ayniqsa, yaqinlik xromatografiyasi va ion almashinuvi xromatografiyasini olib tashlash ta'siriga ega. Ion almashinadigan xromatografiya uchun elyusiya virusni olib tashlashda penetratsiyaga nisbatan afzalliklarga ega. 2-jadvalda Avstraliyadagi CSL kompaniyasi tomonidan albumin ishlab chiqarish jarayonida xromatografik texnologiya yordamida HAVni yo'q qilish tezligining ma'lumotlar statistikasi ko'rsatilgan. 2-jadvaldan ko'rinib turibdiki, ion almashinuvi xromatografiyasi va gel filtratsiyasi HAVni olib tashlashda samaraliroq bo'lib, umumiy olib tashlash tezligi 10,9 Log.

FVIII ishlab chiqarishda Baxter Healthere anti-FVIII antikorlari bilan ishlov berilgan jellar yordamida immunoaffinlik xromatografiyasini o'tkazadi, ular (4,2±0.1)Log va (5,3±0.9)Logni bo'lmaganlardan olib tashlashi mumkin. -mos ravishda PPV va HAV kabi lipid bilan qoplangan viruslar.

 

2. Nanofilm filtrlash

HAV va parvovirus B19 kabi kichik sirt diametriga ega bo'lgan ba'zi viruslar uchun nanomembrana filtrlash eng samarali olib tashlash usuli hisoblanadi. Viruslarni ajratish uchun oqsillar va viruslar o'rtasidagi o'lchamdagi farq va filtr membranasi tomonidan viruslarning adsorbsiyasidan foydalanadi. Gollandiyadagi Sanquin qon ta'minoti saytida protrombin kompleksini ishlab chiqarish jarayoniga bir bosqichli, ikki bosqichli Planova 15N nanomembrana filtratsiyasini qo'shish orqali viruslarni olib tashlash bo'yicha laboratoriya tadqiqoti o'tkazildi. Nanomembrana filtrlashdan so'ng OIV, HAV va boshqa viruslarni yo'q qilish darajasi turli darajalarga ko'tarilganligi aniqlandi (3-jadvalga qarang).

Biroq, ushbu usul sanoat ishlab chiqarishida qo'llanilganda quyidagi muammolar paydo bo'lishi mumkin: Birinchidan, mahsulotning yuqori viskozitesi va katta diametrli oqsillar mavjudligi sababli, filtr tomonidan tanlangan membrananing gözenek hajmi juda kichik bo'lmasligi kerak, shunday qilib, HCV kabi kichik diametrli viruslarni olib tashlashni cheklash; Ikkinchidan, filtr ishlab chiqarish jarayonida membrana gözenek hajmini nazorat qilish barqarorligi virusni olib tashlashga ta'sir qiladi. Uchinchidan, virus zarrachasining diametridan kichikroq membrana teshigi bloklanganda, mahsulot oqimi tezligi pasayadi, bu hosilga ta'sir qiladi. Shu sababli, xossalari va g'ovak o'lchamlari qayta ishlangan mahsulotlarning ehtiyojlariga mos keladigan membranalarni tanlash nanomembrana filtrlash viruslarni olib tashlashi mumkin bo'lgan muhim omil hisoblanadi.

 

3. Munozara

Qon manbai sifatini ta'minlash sharti ostida virusni inaktivatsiya qilish va olib tashlash jarayoni qon mahsulotlari xavfsizligini ta'minlashning muhim va zarur vositasidir. Faqat bitta faollashtirilgan virus jarayonidan foydalanish qon mahsulotlarining xavfsizligini mutlaqo kafolatlay olmaydi. Virusni inaktivatsiya qilish texnologiyasi asosida xromatografiya va nanofilm filtrlash kabi virusni yo'q qilish texnologiyasi qo'shildi, virusni yo'q qilish tezligi sezilarli darajada oshdi va virusni inaktivatsiya qilish va olib tashlash ta'siri sezilarli darajada yaxshilandi. Hozirgi vaqtda Evropa qon mahsulotlarini ishlab chiqarish jarayonida qon mahsulotlarining xavfsizligini ta'minlash uchun kamida bitta inaktivatsiya va viruslarni olib tashlashni qo'llash kerakligini aniq taklif qildi.

Xitoyda ko'pchilik qon mahsuloti ishlab chiqaruvchilari ishlab chiqarish jarayonida Paster dezinfeksiya usuli, S / D usuli va boshqalar kabi faqat bitta inaktivatsiyalangan virus jarayonidan foydalanadilar, ammo qon mahsulotlarining sifatiga jiddiy ta'sir ko'rsatadigan virusni olib tashlash jarayonidan foydalanmaydilar. Xitoyning JSTga a'zo bo'lishi bilan mahalliy qon mahsulotlarini ishlab chiqarish jarayoni va sifat standartlari dunyoga mos keladi, aks holda u mavjud ichki bozor ulushini kafolatlay olmaydi, shuningdek, boshqa mamlakatlardagi shunga o'xshash mahsulotlar bilan raqobatlasha olmaydi. xalqaro bozor.

Shu sababli, Xitoyning qon mahsulotlari ishlab chiqaruvchilari mahsulot sifati va xavfsizligini to'liq ta'minlash uchun ishlab chiqarish jarayonini yaxshilash, virusni inaktivatsiya va olib tashlashni kuchaytirishi kerak. Shu sababli, xitoylik qon mahsulotlarini ishlab chiqaruvchilar uchun qon mahsulotlarini tozalash va qon mahsulotlari xavfsizligini ta'minlash uchun viruslarni olib tashlash uchun xromatografiyadan foydalanish tendentsiyasi bo'ladi.

 

Guidling haqida

 

Guidling Technology - bu biofarmatsevtika, hujayra madaniyati, biomeditsinani tozalash va konsentratsiyalash, diagnostika va sanoat suyuqliklariga qaratilgan milliy yuqori texnologiyali korxona. Biz santrifüj filtr qurilmalari, ultrafiltratsiya va mikrofiltratsiya kassetalari, virus filtri, TFF tizimi, chuqurlik filtri, ichi bo'sh tolalar va boshqalarni muvaffaqiyatli ishlab chiqdik. Ular biofarmatsevtika, hujayra madaniyati va boshqalarni qo'llash stsenariylariga to'liq javob beradi. Bizning membranalarimiz va membrana filtrlarimiz konsentratsiya, ekstraktsiya va oldindan filtrlash, mikrofiltratsiya, ultrafiltratsiya va nanofiltratsiyani ajratishda keng qo'llaniladi. Kichik, bir martalik laboratoriya filtrlashdan ishlab chiqarish filtrlash tizimlariga, sterillik sinovlari, fermentatsiya, hujayra madaniyati va boshqalarga qadar ko'plab mahsulot liniyalarimiz sinov va ishlab chiqarish ehtiyojlarini qondiradi. Guidling Technology siz bilan hamkorlik qilishni intiqlik bilan kutmoqda!